Összegzés

Itt bemutatunk egy protokollt a stroke utáni depresszió kiváltására patkányokban a középső agyartér elzárásával a belső nyaki artérián. A Porsolt kényszerúszási tesztet és a szacharózpreferencia tesztet használjuk az indukált depressziós hangulati állapotok megerősítésére és értékelésére.

Absztrakt

Bevezetés

A stroke a negyedik az elkövető halálos megbetegedések listáján az Egyesült Államokban 1, 2, 3, míg a fejlett országokban a felnőttek fogyatékosságának többségét okozza. Ez a stroke-ot a világ legfontosabb egészségügyi problémái közé sorolja. A stroke-ban túlélők normális állapota ritka, a túlélő áldozatok körülbelül 15-40% -a szenved állandó fogyatékossággal, 20% -uk intézményi ellátást igényel 3 hónappal a stroke kezdete után 5, és a 6 hónapos túlélők körülbelül egyharmada, akiknek másokra van szükségük, hogy átéljék minden nap 6. Nyilvánvalóan a stroke a nemzeti egészségügyi kiadások növekedését is jelenti 7. Az American Heart Association becslései szerint az agyvérzéssel összefüggő költségek az Egyesült Államokban 2010-ben meghaladták az 50 milliárd dollárt 8 .

A stroke nemcsak hosszú távú kárt okoz az egyénekben, de néhány túlélő általában érzelmi és viselkedési rendellenességektől szenved, például demenciától, fáradtságtól, szorongástól, depressziótól, delíriumtól és 9., 10., 11., 12., 13., 14. agressziótól. A stroke után a legtöbbször visszatérő pszichológiai következmény a stroke utáni depresszió (PSD), amelyet a túlélők körülbelül 40-50% -ánál diagnosztizáltak, 15, 16, 17. A stroke okozta depresszió fokozott morbiditást és mortalitást okoz 18, 19, 20, 21, 22. A PSD kórélettana nem teljesen ismert, de úgy tűnik, hogy ezt több tényező okozza, és összefügg a fogyatékossággal, a kognitív károsodással és a sérülés helyével 23 .

A fokális agyi ischaemia patkánymodellje, amelyet Mcao készített, a 24., 25., 26., 27. stroke legelterjedtebb állatmodellje. A PSD patkányokban történő indukciójának bemutatásával a CSF ICA-n keresztüli elzáródásával olyan technikákat alkalmaznak, amelyek minimalizálják a mortalitást és a variabilitást az MCAO-modellben 28 .

Ennek a protokollnak a fő célja az, hogy meghatározza a patkányok PSD kiváltásának lépéseit az MCA elzárásával az ICA-n keresztül, az MCAO módosított modelljén keresztül, amely csökkenti a mortalitást és változékonyságot eredményez 28. Konkrét célkitűzései közé tartozik a neurológiai és szövettani vizsgálatok elvégzése (a neurológiai súlyossági pontszám [NSS], az infarktus zóna térfogatának és az agyi ödéma meghatározása) az MCAO hatékonyságának igazolására, valamint a viselkedési tesztek használata az MCAO eljárás hatásának vizsgálatára az érzelmi rendellenességek, elsősorban a PSD kialakulása.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az izraeli Negev Ben-Gurion Egyetem Állatgondozási Bizottsága jóváhagyta a protokollban alkalmazott összes kezelési és vizsgálati eljárást.

1. patkányok előkészítése a kísérleti eljáráshoz

Jegyzet: Válasszon felnőtt hím Sprague-Dawley patkányokat, amelyek súlya 300-350 g.

  1. A patkányokat ketrecenként négyszer, 22 ° C-os, 40% -os páratartalmú Vivariumban helyezzük el, megfordított 12 órás fény/sötét ciklus (reggel 8 órakor kikapcsol), valamint korlátlan hozzáférés az élelemhez és a vízhez.
  2. A patkányokat véletlenszerűen két csoportba sorolják, nevezetesen egy MCAO csoportba (n = 24) és egy álcsoporthoz (n = 19).

2. patkányok előkészítése műtétre

3. műtét (MCAO technika)

Jegyzet: Végezze el a műtétet Boyko et al. 28. és használja McGarry és mtsai által biztosított eszközöket. 29. és uluç et al. 30 .

  1. Hajtsa végre a ventrális középvonal metszését és boncolja fel a felületes fasciát.
  2. Óvatosan végezzen éles, erőteljes boncolást a három háromszög alakú izomban (szternohioid, digasztrikus és szternomasztoid izom) a carotis artériák (TBI, ICA és közös carotis artéria [CCA]) azonosításához.
  3. Óvatosan boncolgassa és tegye ki a megfelelő CCA-t és ICA-t.
  4. Válasszuk el a jobb CCA-t és az ICA-t a vagus idegtől.
    Jegyzet: A nyaki artériák azonosításával a 3.2 lépésben előírtak szerint az ICA-t a CCA ágainak feleként ismerik el a TBI mellett.
  5. Helyezzen monofil szondát (nylon-tompa vagy szilikon bevonatú 4-0 nylon) közvetlenül az ICA-n keresztül,

4. műtét utáni gyógyulás

  1. Adjon 5 ml 0,9% -os sóoldatot intraperitoneálisan minden patkánynak, közvetlenül a műtét után, a dehidratáció megelőzése érdekében.
  2. A fájdalomcsillapítást feltétel nélkül adják be a műtét utáni első napon; meloxicam 1 mg/kg SQ q24 óra. adjon hígított dipiront (0,5 g 400 ml ivóvízben oldva) azoknak a patkányoknak, amelyek fájdalom tüneteit mutatják az első 3 napban.
  3. Bármely roham patkányát feláldozza (a rohamokat az agyödéma vagy az agyi vérzés okozta megnövekedett koponyaűri nyomás okozza 28).

5. neurológiai súlyossági pontszám 31

Jegyzet: Ezt az eljárást két megfigyelő végzi, akik nem vesznek részt a műtéti eljárásban; 0-4 32 kumulatív pontszámmal tesztelik a neurológiai hiányosságokat és a motoros hiányosságokat. Ennek a pontszámnak az értékelése különböző időközönként végezhető; ebben a vizsgálatban 50 perccel, 24 órával, 7, 15 és 30 nappal a műtét után hajtották végre. Itt vannak a Senna értékelésének lépései. Bár ebben a helyzetben ez nem szükséges, ez a pontszám szükséges a rágcsálók stroke-jának meghatározásához a kezelés beadása érdekében.

  1. Helyezze a patkányt egy kerámia padlóra, és hagyja szabadon mozogni 1 percig.
  2. Óvatosan húzza vissza a patkányt a farkánál fogva, és az alábbiak szerint értékelje.
    1. Pontozza a patkányt 0 ponttal, ha nincs neurológiai hiány.
    2. Értékelje a patkányt 1 ponttal az elülső hajlításhoz.
    3. Értékelje a patkányt 2 ponttal az ellentétes gyenge elülső fogásért.
    4. Értékelje a patkányt 3 ponttal, hogy körbejárja a paretikus oldalt, amikor a farok eldobja.
    5. Értékelje a patkányt a spontán 32 kör 4-es pontszámával .
      Jegyzet: Ha az egyiknél több reakciót észlelnek, akkor a magasabb pontszámú akciót részesítik előnyben.

6. az infarktus térfogatának meghatározása (hisztológiai vizsgálat)

7. agyi ödéma mérése 38

Jegyzet: Az agyi ödémát 24 órával az utolsó MCAO után mértük. Eutanizálják azokat az állatokat, akiknek súlyos neurológiai hiánya legalább három napig zavarja az etetést és/vagy ivást, több mint 20% -os fogyás, hemiplegia vagy görcsrohamok.

  1. Becsülje meg a jobb agyfélteke ödéma nagyságát a koronálisan vágott területek összegének felhasználásával a jobb és a bal agyfélteke térfogatának kiszámításához tetszőleges egységekben (pixelekben).
    Jegyzet: Használja az ImageJ 1.37 v szoftvert ehhez a számításhoz, optikai beolvasás után (felbontás: 1600 x 1600 dpi). Válassza ki az érdeklődési területet, és használja a funkciót méretre a menün elemzés . Makrókat használtunk kutatásunk során.
  2. Fejezze ki az agyödéma területét a nem érintett kontralaterális félteke standard területeinek százalékában.
  3. Számítsa ki a duzzanat mértékét a 39 felett kifejlesztett egyenlet segítségével .

8. viselkedési paradigmák

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Szövettani leletek (Asztal 1) statisztikailag szignifikáns infarktusmennyiséget mutatott ki a teljes agy százalékában (p 2A ábra), és hosszabb ideig mozdulatlan volt (p 2B ábra) A szimulált patkányokkal összehasonlítva.

artéria

1. ábra: A protokoll időrendjének grafikus bemutatása. A különböző teszteket, amelyeket patkányokon futtattak különböző időpontokban, az ábra mutatja: MCAO = a középső agyi artéria elzáródása a kísérlet elején; NSS = neurológiai súlyossági pontszám, 50 perc, 24 óra, valamint 7 és 30 nappal az MCAO után; és viselkedési tesztek (szacharózpreferencia és Porsolt kényszerúszó tesztek) az MCAO utáni 30. és 33. napon. Ezt az ábrát Ifergane és mtsai. Négy öt . Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


2. ábra: A szacharózpreferencia teszt a 30. és 33. nap között, poszt-MCAO-val (n = 16) és álkontroll patkányokkal (n = 14). A szacharózpreferencia százalékos aránya (%). Az MCAO patkányok kevesebb szacharózt fogyasztottak (45. o.) Kattintson ide az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez.


3. ábra: Porsolt kényszerúszó teszt, amelyet a 30. és 33. nap között végeztek az MCAO utáni (n = 16) és az ál-utáni eljárás (n = 14) között. A mozdulatlanság időtartama (másodpercben). Az erőltetett úszási teszt mozdulatlansága lényegesen hosszabb volt az MCAO csoportban, mint a színlelt csoportban (45. o.). Az ábra nagyobb változatának megtekintéséhez kattintson ide.

Szövettani leletek A középső agyi artéria elzáródási csoportja A Sham által működtetett csoport
Teljes agy (infarktus térfogata) 8,8% ± 6,5 0,3% ± 0,1
Agyödéma 10,2% ± 4,6 2,6% ± 1,2
Minden adat a csoport átlagát mutatja ± S. E. M

1. táblázat: Az infarktus és az agyödéma térfogatának szövettani megállapításai. MCAO = agyi artéria középső elzáródása (n = 5); Álszent (n = 5).

Neurológiai súlyossági pontszám A középső agyi artéria elzáródási csoportja A Sham által működtetett csoport
50 perccel a műtét után 2,75 ± 0,14 0,0 ± 0,0
24 órával a műtét után 3,2 ± 0,15 0,0 ± 0,0
7 nappal a műtét után 0,91 ± 0,2 0,0 ± 0,0
Minden adat a csoport átlagát mutatja ± S. E. M

2. táblázat: Neurológiai súlyossági pontszám (NSS) az MCAO és a látszat patkányoknál. MCAO = agyi artéria középső elzáródása (n = 16); Ál (n = 14). Ez a táblázat Ifergane et al. Négy öt .

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Az egyik módot arra, hogy az itt bemutatott MCAO technikát biztonságosabbnak lehetne tekinteni, mint az eredeti MCAO modellt, szemlélteti az a tény, hogy a TBI és ágai, beleértve az occipitalis artériát, a nyelvi terminált és a maxilláris artériát, nem sérülnek-e az MCA ICA-n keresztüli elzárásával. A TCE MCAO eredeti modelljének (és ágainak) lemaradása disztálisan boncolva és koagulálva 46-ban, károsodott rágást okoz, mivel kompromisszumot kötött a rágó izmok érellátásával. Az izom pusztulása végül további számítási folyadékdinamika felszabadulását idézheti elő. Ellentétben azzal az eredeti MCAO-technikával, amelyben az MCA-hoz való hozzáférés a TBI-n keresztül történik, az itt leírt technikát a stroke-ra módosítják, a véráramlás megszakítása nélkül a TCE-ben és mellékfolyóiban.

Az új MCAO modell előnyben részesítésének legfontosabb érvei az eredeti MCAO-val szemben abban rejlik, hogy képes jelentősen csökkenteni az agyi ödéma, az infarktus térfogatának és a súly változásának változékonyságát, valamint csökkenti az MCAO-val összefüggő mortalitást. Az MCAO-eljárások mortalitása fontos tényező 48; a 20% -os halálozási arány ésszerűnek tekinthető 49, 50. A halálozás aránya (az eredeti MCAO esetében 20%, az új MCAO esetében 12,5% és a kontroll esetében 0%) a jelenlegi vizsgálatban mind az elfogadható arány tartományába esett, de az új MCAO technika jobb volt, mint Eredeti MCAO.

Az új MCAO eljárásnak alávetett patkányok közvetlenül a műtét után kevesebb súlyt vesztettek, és a vizsgálat végén nagyobb súlyra tettek szert, mint az eredeti MCAO 28 technikának alávetett patkányok. Az eredeti MCAO-n átesett patkányok nagyobb súlycsökkenést és kevesebb súlygyarapodást eredményezhetnek az ACE ligandum műtét során, ami distalis hypoperfúziót okozhat az arc-, a nyelv- és a maxilláris artériákban, valamint az ischaemia okozta károsodásokat okozhatja a rágást támogató izmokban. Ha a rágás romlik, csökken a szájon át történő bevitel, ami a katabolizmussal kombinálva súlycsökkenést, hosszú távon pedig rossz neurológiai eredményt, morbiditást és halált okozhat 43. Az MCI-hez való hozzáférés az ACI-n keresztül nem igényli a TCE és annak ágai beavatkozását. Ezért az új MCAO eljárás során nem váltanak ki akadályokat, és az eljárásban részt vevő patkányok nem tapasztalnak súly-, morbiditási vagy mortalitási problémákat.

Az alapul szolgáló depressziós tényezők, például a depressziós viselkedés, az anhedonia, a mozdulatlanság, valamint a tanulási és memóriazavarok értékelésére használt tesztek az 51-es, 52-es depresszió állatmodelljeiben alkalmazott standardizált eljárások. Egy viselkedési tesztet, például a Porsolt kényszerúszó tesztet általában befolyásolják a szokatlan motoros képességek az MCAO után. Itt ezt a tesztet a műtéti beavatkozást követő 30. és 33. nap között alkalmazták annak megállapítására, hogy a módosított MCAO patkányokban a PSD indukciója nem befolyásolja túlzottan a motorikus képességeiket. Az eredmények szerint a kísérleti csoportba tartozó patkányok teljes menekülési viselkedést mutattak, összehasonlítva az álkontroll patkányokkal. Az MCAO patkányoknál szignifikánsan több menekülési kudarc volt, jelentősen megnőtt az immobilitás időtartama, és csökkent a szacharóz előnyben részesítése az álműtött állatokhoz képest. Ez azt sugallja, hogy ez az MCAO technika képes az eredeti MCAO módszer alternatívájára.

A tágabb kísérleti értékeléshez a patkányok MCAO-eljárásba történő felvétele és kizárása közötti különbség nagyban függ a művelet eredményétől. Az MCAO-val kapcsolatos PSD indukciós modell alkalmazásával az MCAO néhány nem kívánt mellékhatása csökkenthető, hagyva helyet kisebb és esetleg törékeny patkányok bevonására az MCAO eljárásba. Az itt bemutatott MCAO állatmodell olyan forgatókönyvet nyújt, amely csökkenti a nem kívánt eredményeket az MCAO által kiváltott PSD után, mivel ez képes csökkenteni a súlyváltozások, az agyödéma és az infarktus térfogatának változékonyságát, valamint a kapcsolódó halálozásokat az MCAO-val. Ez a technika eszközül szolgálhat a jövőbeni PSD-terápiák értékeléséhez, és preklinikai adatokkal szolgálhat a terápiás anyagok hatékonyságáról, valamint figyelemmel kísérhet más tényezőket, amelyek módosítják a stroke és a PSD klinikai kimenetelének modalitásait.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.