Összegzés

Az akut agyi trauma olyan súlyos sérülés, amelyet a mai napig nem kezeltek megfelelően. A multifoton mikroszkóp lehetővé teszi az akut agyi trauma kialakulásának longitudinális vizsgálatát és a rágcsálók terápiás stratégiáinak feltárását. Az akut agyi trauma két modelljét in vivo kétfoton agyi képalkotással vizsgálták.

Absztrakt

Bevezetés

Az akut agykárosodás közegészségügyi probléma, gyakran fordul elő autóbalesetek, esések vagy támadások során bekövetkező sérülések száma, és a későbbi krónikus fogyatékosság nagy gyakorisággal fordul elő. Az agykárosodás kezelésének terápiás megközelítése továbbra is teljesen tüneti, korlátozza a kórház előtti, műtéti és kritikus ellátás hatékonyságát. Ez különösen súlyosvá teszi az agysérülés társadalmi és gazdasági hatásait. Különböző okokból a legtöbb klinikai vizsgálat új terápiás megközelítések alkalmazásával nem mutatott javulást az agysérülés utáni gyógyulásban.

Az állatmodellek döntő fontosságúak az új terápiás stratégiák kidolgozásában olyan szakasz felé, ahol a gyógyszer hatékonysága megjósolható az agykárosodott betegeknél. Jelenleg a fej traumájának számos jól bevált állatmodellje létezik, ideértve az ellenőrzött kortikális ütközést 1, a folyadék ütéses sérülését 2, a dinamikus kérgi deformációt 3, a súlycsökkenést 4 és a fényképes sérülést 5. Számos kísérleti modellt alkalmaztak tanulmányozza a fej traumájához kapcsolódó patológia néhány morfológiai, molekuláris és viselkedési aspektusát. Azonban egyetlen állatmodell sem teljes siker az új terápiás stratégiák érvényesítésében. Megbízható, reprodukálható és kontrollált agysérüléses állatmodellek kidolgozása szükséges a komplex kóros folyamatok értékeléséhez.

Itt javasoljuk a fecskendő tűvel történő sztereotaxiás szúrási módszert, amely kombinálható a gyógyszer egyidejű helyi alkalmazásával, az agy lokális sérüléseinek fejlett modelljeként és eszközként az akut traumák patofiziológiai következményeinek tanulmányozására az emlős agyában. in vivo.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Jegyzőkönyv

Az itt bemutatott összes eljárást az állatgondozásról szóló helyi útmutató szerint hajtották végre (az állatkísérletekről szóló finn törvény 62/2006). Állati engedélyt (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a helyi hatóságoktól szerezték be (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). 1-3 hónapos felnőtt, 24-38 g súlyú egereket az egyetem tanúsított állattartó létesítményeiben egyedi ketrecekben tartottak, mindig ad libitum étellel és vízzel.

1. Az agyi sérülés leképezése egy koponyaablakon keresztül

2. Agykárosodás képalkotása a hígított koponyán keresztül

0,5-1,5 mm átmérőjű. Fúrás közben használjon sűrített levegőt a csontmaradványok eltávolításához. A súrlódás okozta túlmelegedés elkerülése érdekében a hígítási eljárás során szakaszosan végezze el a piercinget. Hűtsük le a fúrót az oldat segítségével szobahőmérsékletre, és időnként tegyünk puffert a vékonyított területre a hő elnyelésére.
MEGJEGYZÉS: A kéreg károsodásának elkerülése érdekében ne fúrjon nagy területeket (> 1,5 mm) vékony rétegre (előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t a könyvtárosának.

Reprezentatív eredmények

Két operációs eljárást optimalizáltunk: 1) a krónikus koponyaablakot és 2) a koponya elvékonyodását, poszttraumás agyi képalkotással transzgenikus egerekben. A kísérleti készítmények vázlatos képét a 1.ábra. A fúrt kútra 0,3 mm OD (30 g) acél tűvel történő traumás szúrást alkalmaznak (1A. Ábra). A koponyaablak sikeres előkészítése lehetővé teszi a képalkotást akár 650 m mélységben a pial felszín alatt (1B. Ábra), míg a koponya elvékonyodása általában körülbelül 300 mikron határértéket szab (1C. Ábra), amint azt a Thy1-YFP-H egér kérgi piramisszerű neuronok 3D rekonstrukciója bizonyítja.

A defektes trauma dendrit eltávolítását és a kapilláris hálózatok megsemmisítését eredményezi az agykéreg ellenőrzött térfogatában. Az első két nap során a sérülés területe növekszik, és a trauma dendritbélképződést és a dendritikus bULB visszahúzódás kialakulását idézi elő a perilesion területeken, amint azt többfoton mikroszkóppal in vivo megfigyelték. (2. ábra).

A koponya elvékonyodását a kép aktiválásával és a mikroglia migrációval végeztük CX3CR1-EGFP egerekben közvetlenül a sérülés után. (3A. Ábra). Az SHG képalkotás értékes eszközt kínál a sérülés helyének pontos körülhatárolásához (3B. Ábra). Az extracelluláris mátrix molekulák, amelyek az önsegítő csoportokból származó jeleket produkálnak, nagymértékben gazdagodnak az agy parenchymájában a tűszúrás traumájában. Először a finom mikroglia folyamatok helyreállnak, majd a mikroglia sejtek a sérülés helyének szélére vándorolnak (3A. Ábra).

A vékony üvegpipetta behelyezésével és a festék bejuttatásával kiváltott lehetséges elváltozások megbecsléséhez in vivo kétfoton mikroszkópos kísérleteket végeztünk Sulforhodamine 101 mikroinjekcióval Thy1-YFP-H egerekben agyi trauma nélkül. A reprezentatív képek 4. ábra mutassuk be a millassit croinjection-t 3 órával az injekció beadása után. A pipetta behelyezésének nyoma az SHG által vizualizált agyi agyhártyákon látható (4A. Ábra). Az asztrocitákat injekcióval bevezetett Sulphorodamine 101-gyel jelölik (4B. Ábra). Azok a dendritek, amelyek YFP-t expresszálnak a Thy1 promoter alatt, nem mutatják a sérülés morfológiai jeleit, mint például az izzók lefújása vagy visszahúzódása (4. ábra C).

akut

1. ábra: Akut agykárosodási módszer koponyaablak vagy koponya vékony készítményekkel kombinálva, in vivo kétfoton mikroszkóppal kombinálva. NAK NEK. A kútfúráshoz 0,3 mm OD (30G) acél tűvel végzett traumás szúrás. A tűt rövid ideig az agyba mártjuk, 0,5-2 mm mélyre a kút aljától. IDŐSZÁMÍTÁSUNK ELŐTT . Thy1-YFP-H egér kérgi piramis idegsejtek 3D rekonstrukciója a kísérleti készítmények sárga és vázlatos nézetében. A vékonyított koponya második harmonikus generációs (SHG) jel szürke színnel jelenik meg (C). D. Világos látómező felületi erek az üvegablakon keresztül, közvetlenül akut agysérülés után. ÉS. Hígított koponya a sérülés alkalmazása előtt. A kiválasztott érdeklődési terület (fehér keret) és a szúrás helye (piros kör). A elvékonyított régió egy másik területét (piros doboz) kell ábrázolni a műtét által kiváltott esetleges műtermékek figyelemmel kísérése érdekében.


2. ábra: Példa a vékonyított koponyán keresztüli agytraumák fejlődésének longitudinális multifoton képalkotására. A. A kortikális idegsejtek YFP-jelölt dendritjeivel körülvett sérülési hely paravista p 20 perccel a trauma bekövetkezése után, amint az a soványított koponya előkészítésén keresztül tükröződik. B. A panelen megjelenített terület nagyított nézete A. C. Az agy ugyanaz a területe, mint az B, 5 nappal a traumát követően képzeltük el. A fehér nyilakkal ábrázolt dendrit-elvezetés, a dendrites visszahúzódás-izzók - piros nyilakkal.


3. ábra. Példák a gyulladás monitorozására és a glia aktiválására traumás agysérülés kialakulása során a fehérjék in vivo képalkotására alkalmas különböző markerek alkalmazásával, pl. Fluoreszcens, festék és második harmonikus generációs jel. A képeket 3 órával az agy sérülése után készítettük. A. GFP-expresszáló mikroglia aktiváció (zöld) és vándorlás akut agykárosodás után a koponyaablakon keresztül visszaverődve a CX3CR1-EGFP egerekben; második harmonikus generáció (SHG) szürke színnel. B. GFP-expresszáló (zöld) és sulforhodamine 101 jelzett (vörös) asztrociták a sérülés helye körüli GFAP-EGFP egerekben, amelyet az extracelluláris mátrix molekulákból származó erős második harmonikus generációs jel (szürke) jellemez. A nyilak a mikroglia sejtekre mutatnak példákat (NAK NEK) és asztrociták (B) sérülés után. A sérülés helyének határát azonosítják az önsegítő csoport előjellel, és szaggatott vonallal ábrázolják.


4. ábra A szöveti ütésvizsgálat az oldat üveg mikropipettán keresztül történő befecskendezésével. NAK NEK. Nyom (szaggatott vonallal ábrázolva) SHG-ben, amely az agyi agyhártyákat jeleníti meg 3 órával az injekció beadása után. B. Szulforodamin-jelölt asztrociták injektálás útján. C. Dendritek, amelyek az YFP-t expresszálják a Thy1 promoter alatt. D. Kombinált kép NAK NEK (SHG - szürke), B (asztrociták - piros), C (neuronális dendritek - sárga).

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.

Vita

Az agytrauma hirtelen kiszámíthatatlan esemény. Itt leírjuk azt az állatmodellt, amely reprodukálja az agysérülés után az emberi betegeknél megfigyelt patológiás változások spektrumát, mint például a neurodegeneráció, a dendrit eltávolítása, az agyödéma, a glia heg, az agykéreg vérzése, valamint a fokális subarachnoidális vérzés és a vér-agy gát. Az elsődleges és szekunder patogenezis, valamint a trauma utáni gyógyulás tanulmányozásához ezt a sérülési modellt kombinálták a neuronális és glia struktúrák longitudinális in vivo vizualizációjával. Transzgénikus egerek sorait alkalmaztuk, amelyek fluoreszcens fehérjéket expresszálnak az idegsejtekben (Thy1-YFP-H) 7, asztrocitákban (GFAP-EGFP) 8 vagy mikrogliaban (CX3CR1-EGFP) 9. Ezenkívül második harmonikus generációt (SHG) is alkalmaztunk) az asztrociták képalkotása és betöltése Sulfarhodamine 101 10-vel.

Az itt leírt modell összefoglalja az átható agykárosodás típusát. Ezért ennek a modellnek korlátja, hogy nem nyújt információt a zárt fejsérülés mechanizmusairól. A közelmúltban Espada és társszerzői többfoton képalkotási eredményekről számoltak be a sejtek viselkedésében a perikontuszionális kéregben 6. Figyelembe véve, hogy a zárt fejsérülés gyakoribb orvosi eset, a szerzők által közölt módszertani megközelítés nagyon ígéretes kiegészíteni a hagyományos kutatási módszereket az agy trauma trafikja 11.

A krónikus 12 koponyaablakot és a 13 koponyahígító készítményt egyaránt alkalmaztuk a sejtek viselkedésének vizsgálatára poszt-traumás körülmények között az élő agyban. Mindkét módszer bizonyos előnyökkel és korlátokkal rendelkezik. Így a krónikus koponyaablak jobb felbontást, az optikai behatolást mélyebben az agyszövetbe és kényelmet biztosít több képalkotó munkamenethez. Ezzel szemben a koponya elvékonyodása kevésbé valószínű, hogy gyulladást vált ki a képalkotó helyen, és ami még fontosabb, lehetővé teszi a gyógyszerek és színezékek ismételt alkalmazását. Az ilyen típusú kísérletekben alkalmazandó farmakológiai szerek néhány példája a következőkben található Asztal 1.

1. táblázat: A kortikális injekcióhoz szükséges farmakológiai szerek és festékek a defektkárosodás modelljében.

A fiziológiai és kóros körülmények között rendkívül fontos biokémiai események széles skálája kémiai inhibitorokkal, fluoreszcens riporterekkel és a vírusszerkezetek révén bevezetett mutáns fehérjékkel vizsgálható. A koponyavékonyodás előkészítésének bizonyos időablak kiválasztásának előnyei nagy jelentőségűek lehetnek a vizsgálatok szempontjából.

Jelen tanulmányban második harmonikus generációs szignált használtunk az elváltozás területének körülhatárolására. Alternatív megoldásként a sérülés helyének határait gyengén diffúziós fluoreszcens festékkel, például nagy molekulatömegű fluoreszcens dextrán konjugátummal (2 millió Dalton) lehet jelezni.

A közelmúltban Schaffer és munkatársai 14 újranyitható koponyaablakkal rendelkező krónikus készítményt alkalmaztak fluoreszkáló festékek ismételt bejuttatására az egér kéregébe. Valószínű, hogy a koponyaablak újbóli megnyílása hátrányosan befolyásolhatja az agyszövet átlátszóságát. Másrészt nehéz megjósolni az újranyitás által kiváltott gyulladás időbeli lefolyását, amely befolyásolhatja a kötőszövet regenerációját.

A soványított koponya készítmény nagy előnye, hogy terápiás vegyületeket (és más anyagokat igényel, amelyek helyi injekciót igényelnek az agyszövetbe) többször is be lehet juttatni a trauma előrehaladása során, anélkül, hogy bonyolítaná a műtermékeket (például a koponyaablak újbóli megnyitása nélkül).

Azokban az esetekben, amelyek nem igényelnek közvetlen hozzáférést a sérülés területéhez, nagyon ajánlott, hogy takarja le a koponya elvékonyodott területét fedőüveggel, ahogy azt Kleinfeld és munkatársai a Polírozott és megerősített soványított koponya előkészítése című cikkben leírják. 15. Ez a következő opcionális eljárással hajtható végre. Helyezzen egy kis csepp agarózt (1,5%) a elvékonyodott koponyarégióra, várja meg, amíg gélré válik, távolítsa el az összes felesleges agarózt, vagyis hagyja csak a sérülés helyén. Az agaróznak meg kell védenie a sérülés helyét a külső hatásoktól. Szárítsa meg a koponya területét sűrített levegővel hígítva. Cseppentsen kis mennyiségű akrilragasztót a # 0 fedőlap kis darabjára, és tegye a vékonyított koponyarészre. A poliakril ragasztó megakadályozza a csont és a kötőszövet újratermelését, így a koponya elvékonyodik a megőrzött ablak alatt.

Ezen eljárások kombinációja lehetővé teszi az akut és krónikus poszttraumás folyamatok tanulmányozását, a gyógyszerek helyi vagy szisztémás úton történő beadását és a kezelés hatásainak közvetlen nyomon követését. Kettős vagy hármas transzgénikus egérvonalak alkalmazása szintén előnyös lehet, különösen több poszttraumás folyamat egyidejű leképezésére, mint például a glia hegképződése és az elágazás idegsejtjeinek újratermelése. Reméljük, hogy az akut agykárosodás modelljeink intravitális kétfoton mikroszkóppal tanulmányozták, hogy eredményesek legyenek a jelölt gyógyszer tesztelésében.

Előfizetés szükséges. Kérjük, ajánlja a JoVE-t könyvtárosának.