Az új technika forradalmasítja a géntechnológiát. De vajon a CRISPR/Cas9 molekuláris olló olyan előnyös-e, mint ígérik?

technika

A CRISPR/Cas9 génszerkesztési technika úgy működik, mint a szelektív olló, amely nagy pontossággal és hatékonysággal vágja le és módosítja a genom bármely szekvenciáját. De vajon mindig megbízhatóak-e? [iStock/vchal]

A géntechnológia megújulási lökést tapasztal. Egy évtizeddel az emberi genom projekt után, amely nem minden várt eredményt hozott, megjelent egy technika, amelynek lehetőségei végtelennek tűnnek. A CRISPR/Cas9 molekuláris olló, amely példátlan pontossággal módosítja a DNS-t a kiválasztott pontokon, új reményt kelt. A stratégia már forradalmasítja a géntechnológia minden területét, és vitathatatlannak tartják, hogy felfedezői méltók lesznek a Nobel-díjra. A módszer azonban nem mentes a problémáktól. Az általa kiváltott nem kívánt hatások, technikai korlátozások és etikai kifogások a génszerkesztés fő akadályait jelentik.

Hogyan működik a CRISPR/Cas9?

A CRISPR/Cas9 génszerkesztési technika a baktériumok komplex immunrendszerén alapul, amely megvédi őket a vírusoktól. Ez egy megszerzett vagy adaptív immunitás, amely "megjegyzi" a kórokozók DNS-szekvenciáit a korábbi támadásokból, és új fertőzés esetén levágja a DNS-eket.

A felismerés és a vágás éppen ezt a kombinációját használja a CRISPR/Cas9 technika. A legegyszerűbb változatban a Cas9 nevű fehérjét és egy felismerési szekvenciát kódoló RNS-t injektálunk a sejtbe. A sejt az RNS segítségével szintetizálja a fehérjét, amelyet a hozzáadott felismerő RNS-sel együtt működtetnek: a Cas9 pontosan oda vágja a kettős szálú DNS-t, ahol a kapcsolódó RNS-fragmens megmondja. Mivel bármilyen RNS-szekvencia mesterséges szintetizálása lehetséges, egy ilyen kombináció lehetővé teszi bármely genom bárhol történő vágását, legalábbis elméletileg.

Az úgynevezett CRISPR szekvenciák, amelyek a baktériumok genetikai anyagában vannak jelen, az 1980-as évek óta ismertek. Francisco J. M. Mojica mikrobiológus, az Alicante Egyetem munkatársa alapvetően hozzájárult annak felfedezéséhez és elnevezéséhez. A rövidítés a "rendszeresen elhelyezett, csoportosított rövid palindrom ismétlődések" kifejezésre utal, vagyis olyan rövid palindrom szekvenciákat ismétel, amelyeket más genetikai anyag választ el egymástól, és amelyek gyakran megjelennek a genomban meghatározott helyeken. Kiderült, hogy az ismétlődő szekvenciák közötti genetikai anyag gyakran vírusokból származik, ami arra a következtetésre vezetett, hogy a CRISPR megfelel egy olyan rendszernek, amely lehetővé tette a baktériumok számára, hogy megvédjék magukat ellenük.

Később megfigyelték, hogy az ezzel a rendszerrel rendelkező összes baktérium a CRISPR közelében társított géneket hívott cas-nak. Ezek alkotják az antivirális védekezés alapvető elemét. A baktériumban található CRISPR rendszer "kinyeri" a vírus DNS-t és integrálja annak egy részét a baktérium genom ismétlődő szekvenciái közé. Ennek eredményeként a sejt a vírus DNS-sel komplementer RNS-t termel, és összeállítja azt Cas fehérjékkel. Ha egy vírus megpróbálja újból megfertőzni a sejtet ezzel a DNS-sel, az RNS "felismeri" a vírus genomját, majd a Cas fehérjék úgy vágják le, hogy az ne okozzon ismét kárt.

A génszerkesztési technika eredete azon a felfedezésen alapul, hogy a Cas fehérjék bármilyen DNS-t kivágnak, amennyiben megfelelő felismerési RNS-sel rendelkeznek, és ezt teszi a CRISPR/Cas9. A vágás után a sejt természetes helyreállítási mechanizmusaira támaszkodnak, amelyek spontán indulnak el.

Ha ekkor a genomnak csak a két részét választják el, akkor egy sejtjavító mechanizmus lép közbe, amely újra összeköti őket, bár gyakran pontatlan, és úgynevezett indeleket, kis DNS-fragmenseket állít elő, amelyeket a vágáskor illesztenek be vagy eliminálnak, és letilthatja az érintett géneket. Amikor azonban a DNS szabadon lebeg a sejtben a két laza végével, egy másik pontosabb rendszer, az úgynevezett homológ rekombinációs javítás (HDR) lép közbe, amely újra összeköti őket, és specifikus változásokhoz vezet a genomban.

Mik az etikai kérdések?

A szakértők régóta vitatják az emberek genetikai módosításával kapcsolatos alapvető etikai kérdéseket. De a vita eddig pusztán hipotetikus volt, mivel az eljárások túl nyersek és pontatlanok voltak ahhoz, hogy komolyan át lehessen fordítani őket emberi kísérletekbe. De a génszerkesztés elvileg lehetővé teszi a genom változásainak nagy pontossággal történő bevezetését. Valójában már 2015-ben több kínai munkacsoport beszámolt arról, hogy a CRISPR/Cas9 módszerrel megpróbáltak bizonyos örökletes betegségeket kiküszöbölni az emberi embriókból. A betegségeket okozó gének helyreállítása jelenleg a legkézenfekvőbb alkalmazás az embereknél, mivel senki sem emelhet kifogást ennek terápiás céljaival szemben.

Vagy tulajdonképpen igen? A kritikusok attól tartanak, hogy az ilyen eljárások tovább halasztják a "genetikai hiba" meghatározását, amíg a legszükségesebb genetikai változat kivételével az összes hibásnak tekinthető, és ezért javításra szorul. A csecsemővonal módosításainak etikájával kapcsolatos, többé-kevésbé hasznos megfontolás tárgyát képező, tervező baba a gyógyítás ürügyén jelenik meg.

A legsürgetőbb probléma azonban nem a tervező csecsemők lehetséges következményei, sokkal inkább azok a következmények, amelyeket az ilyen kísérletek a tényleges genetikai hatások rendkívül hiányos ismereteire tekintettel fognak gyakorolni. Az "egyedi" baba létrehozásának kutatása évtizedeket vehet igénybe, de nem világos, hogy egy ilyen várakozás mindenkit elriaszt-e. Lehet, hogy az ilyen kísérleteket egyszerűen tiltják, mivel 2015-ben a kísérletek növelik bizonyos vírusok fertőzőképességét.

Éppen ellenkezőleg, az öröklött betegségek felszámolása már napirenden van. Bizonyos esetekben egyetlen gén, esetleg egyetlen allél korrigálása valószínűleg hamarosan megvalósítható. A legtöbb szakértő ezt az opciót etikailag igazolhatónak tartja. Még ebben az esetben is fennáll annak a kockázata, hogy a beavatkozás kiszámíthatatlan hosszú távú következményekkel járhat, ha például a korrigált gént átadják az utódoknak, és olyan hatással van rájuk, amire senki sem számított. A közelmúltban óriási vitákat váltott ki egy kínai kutató meglepő bejelentése, miszerint ikerlányoknak adott életet, akiknek genomja szerkesztett volt, hogy megvédje őket a HIV-től.

Ma a CRISPR/Cas9 és a kapcsolódó módszerek már forradalmasítják az összes olyan területet, ahol a genetikai módosítás érdekes lehet. A genetikai szerkesztés könnyebb és pontosabb, mint bármely más, eddig tervezett technika. De mindenekelőtt egyértelműnek kell lennie, hogy mit jelent a "genetikailag módosított organizmus": van-e olyan, amelynek egy génje a CRISPR/Cas9 által módosított egy helyen? Vagy csak új változatot adott a természetes génállományába? Disznó endogén retrovírusai nélkül, mint bármely más disznó?

Érdekes lesz látni a fogyasztók reakcióját, amikor ilyen organizmusok foglalják el a szupermarketek polcait, mint termékek a „természetes” és „mesterséges” küszöbön. Később ezen a ponton a géntechnológia meghatározásának valódi technikai kérdése érzelmessé válik. Sokan nem akarnak semmit sem látni a tányérjukon, ami "genetikailag módosított"; de ehhez szükség lesz a módosított organizmusok felismerésére, még akkor is, ha megváltozott génjeik nem különböznek a természetes változatoktól, ezért változatlan organizmusokkal is hibridizálódhatnak. Ilyen átláthatóság aligha lenne lehetséges a jelenlegi rendszerrel, különösen az állatállomány tekintetében.

A CRISPR/Cas9 körüli etikai megfontolások szintén foglalkoznak/egyensúlyban vannak a technika tervezett előnyei és kockázatai között, például a genomban lévő nem kívánt helyek módosításának lehetőségében. Az ökoszisztémák akkor is veszélybe kerülhetnek, ha szúnyogokat vagy géntechnológiával módosított mezőgazdasági termékeket engednek szabadon. Az sem világos, hogy mekkora a veszélye annak, ha a módosított genetikai anyag más fajokra ugrik. Másrészt nehéz megjósolni a technika feladásának következményeit, amikor megpróbál gyógyítani egy betegséget. Ebben az esetben az erőteljes CRISPR/Cas9 szembeszállása alapvető hátrányai ellenére sem kevésbé vitatott.

Milyen korlátai vannak a CRISPR/Cas9-nek?

Biológiai eredetéből adódóan a CRISPR/Cas9 a pusztítás eszköze: a kettős szál törése a genom meglehetősen drasztikus beavatkozását jelenti, és gyakran nem lehet helyrehozni maradandó károsodás nélkül. Ez a tulajdonság hasznos lehet, ha egy gént úgynevezett indelekkel próbálunk letiltani: bázispárok, amelyeket eltávolítunk vagy hozzáadunk, és olvashatatlanná teszik a genom szakaszát. Sajnos indeleket is előállítanak néha, amikor további DNS-t építenek be a HDR javító rendszeren keresztül.

Ha nagy pontosságú genetikai módosításra van szükség, mint a génterápiákban, az eredeti CRISPR rendszerben a kettős szálú törések alapvető problémát jelentenek, amelyet el akarnak kerülni. Az újabb CRISPR/Cas9 variánsok például csak egy szálat vágnak le, jelentősen csökkentve az indeleket a genom nem kívánt helyein, és jelentősen javítva a technika pontosságát.

Ennek ellenére a CRISPR/Cas9 rendszer nem kívánt változásai, azok, amelyek a genomban a szándékoltól eltérő helyeken történnek, soha nem kerülhetők el teljesen. Ezekre azért kerülhet sor, mert a Cas9 vágóenzim akkor is működik, ha a felismerési RNS legfeljebb öt helyen különbözik a DNS-szekvenciától. Az ilyen hibákat később rendkívül nehéz azonosítani. Vagy ellentétes hatás fordulhat elő állítólag inaktivált géneknél: annak ellenére, hogy a kívánt mutációt a megfelelő helyre beépítik a genomban, a gént továbbra is helyesen „olvassák”.

A jelenlegi CRISPR/Cas9 technikának más problémái is vannak. Annak ellenére, hogy pontosan meghatározhat egy meghatározott helyet a genomból, megköveteli, hogy egy olyan specifikus génszekvencia létezzen a közvetlen közelében, amely nem választható ki tetszés szerint. Ez a legtöbb genomban így van, bár nem mindegyik (és természetesen soha nem az, amin dolgozik). Ezenkívül a CRISPR/Cas mechanizmusa nagyon terjedelmes, ami megnehezíti a korai emlős embrionális sejtekbe történő bejuttatását: a cas gén és a felismerő RNS egyszerűen túl nagy az általánosan használt genetikai "transzporterek", vírusok számára, amelyek genetikai anyagot juttatnak a sejtbe. érdekes. Az RNS-t közvetlenül kell beadni, korlátozva a hatékonyságot.

Valójában a génszerkesztési technika egyik legfontosabb paramétere a hatékonysága; Más szavakkal, a kívánt genom milyen arányban módosul a kívánt módon. A manapság alkalmazott genetikai ollók egyike sem garantálja, hogy teljesíteni fogják küldetésüket; valójában ennek valószínűsége viszonylag alacsony, még a legígéretesebb alkalmazásokban is. A CRISPR/Cas9 valójában nem vesz részt az érdeklődő gén szerkesztésében. Ez többé-kevésbé véletlenszerűen történik. Indukált pluripotens humán őssejtekben például a CRISPR/Cas9 hatékonysága 2 és 5 százalék között van. Más rendszerekben, például a zebrafish embriókban a sikeres mutáció valószínűsége néha meghaladja a 70 százalékot, bár az öröklött halbetegségek génterápiája nem túl nagy piac.

Milyen jövőbeni alkalmazásai lesznek a CRISPR/Cas9-nek?

A biotechnológiai kutatásban a CRISPR/Cas9 kiváló pozíciót ért el géntechnikai eszközként. Sőt tovább ment az új verziókkal, amelyek lehetővé teszik a génaktivitás specifikus szabályozását a laboratóriumban. Ehhez egy inaktivált Cas9 fehérjét használnak, amely csak határozottan tapad bizonyos DNS-darabokra. Ha egy ilyen fehérje egy promóter doménhez kötődik, akkor a megfelelő gén aktivitása megnő. Ha ehelyett blokkolja maga a gén szekvenciáját, akkor a megfelelő genomszektor leáll az RNS-vé. Az inaktív Cas9 rendszerekhez kötött különböző fehérjék segítségével most már lehetőség van epigenetikai hatások feltárására is, például bizonyos szekvenciák térbeli helyzetének fluoreszcens jelölésével. A metil- vagy acilcsoportokat hasító vagy megkötő kapcsolódó enzimek révén az ilyen CRISPR/Cas9 rendszerek szintén megváltoztathatják a sejtek epigenetikáját.

De mindenekelőtt a CRISPR/Cas9-et arra használják, hogy nagyon hatékonyan hozzanak létre genetikailag módosított szervezeteket, olyanokat, amelyekben egy bizonyos gént egy mutációval módosítottak, inszertáltak vagy inaktiváltak. Az ilyen eljárások sokkal régebbiek, mint a CRISPR. 2007-ben például az úgynevezett genetikai kiütés kitalálóinak fiziológiai vagy orvosi Nobel-díjat adtak. A CRISPR/Cas9 technika azonban gyorsabb, olcsóbb és sokoldalúbb, mint a korábbi módszerek. A CRISPR egyik fő problémája a laboratóriumban is megoldható: az RNS szükséges mérete. Jelenleg például számos olyan egérfaj létezik, amelyek a saját genomjukban hordozzák a Cas9 fehérjét; amint egy bizonyos molekuláris jel, például a megfelelő felismerő RNS eljut a sejtbe, a molekula megvárja a genom megváltoztatását.

Az első módosított organizmusok is folyamatban vannak, amelyek célkitűzése az alapkutatáson túl gyakorlati alkalmazásokkal is rendelkezik. Ilyen módon, ha a tudósok tervei sikeresek lesznek, a jövőben jobb állatmodelleket állítanak elő különböző emberi betegségekre, valamint kifejlesztenek bizonyos jellemzőkkel rendelkező növényeket és állatokat, például maláriarezisztens Anopheles szúnyogokat is. Érdekes példa a potenciálisan veszélyes retrovírusok sertés genomjában történő eltávolítása, amely fontos követelmény az állatok emberi szerveinek létrehozására irányuló terv előtt.

Ezenkívül a CRISPR/Cas9 továbbfejlesztette a génmeghajtásnak nevezett technikát, amely mechanizmus révén bizonyos mesterséges tulajdonságok gyorsan terjednek a vadállatok populációiban. Ez érdekes a súlyos betegségeket átterjesztő szúnyogok elleni védekezésben egyes régiókban. Az orvosi kutatások a CRISPR/Cas9-re is összpontosítottak, mint a kórokozó vírusok és baktériumok leküzdésének eszközére, annak érdekében, hogy pontos vágásokat végezzenek ezeknek a mikroorganizmusoknak a DNS-ben, és megakadályozzák azok fejlődését. Azonban még mindig nem teljesen világos, hogyan lehet a szükséges RNS-t valódi betegségben a kívánt helyre szállítani.

Milyen alternatívák léteznek a CRISPR/Cas9 technikának?

Egy biztos: annak ellenére, hogy egyrészt Emmanuelle Charpentier, Jennifer Doudna, másrészt Feng Zhang szabadalmi vitájában döntöttek, a CRISPR/Cas9 módszer előnyeiért folytatott harc csak most kezdődött el. A technika óriási lehetőségei miatt a jogdíjak milliárdok. De ha perspektívában nézzük, talán nem is. Míg a Kaliforniai Egyetem még mindig képes legalább egy darab tortát megszerezni, különféle kutatócsoportok a technika egyéb lehetőségeit kutatták.

Mivel a CRISPR/Cas9-nek, amint láttuk, vannak hátrányai és korlátai. A legfontosabb az, hogy a genetikai olló valójában csak a DNS vágására alkalmas. Ha új genetikai anyagot szeretne beépíteni, bíznia kell a sejtben. Sok esetben a technika nem elég hatékony ahhoz, hogy a kívánt módon több gént is módosítson egyszerre. Továbbá a CRISPR/Cas9 nem vág le minden genomhelyet.

Emiatt a CRISPR/Cas9-et megelőző módszereket nem hagyták el teljesen: mind a TALEN, mind a cinkujj nukleázokat, két régebbi genetikai ollót továbbra is használják a géntechnológiában. Ezek az eljárások sokkal bonyolultabbak. Ha azonban a CRISPR/Cas9 hátrányai mellett még több évig fennáll a bizonytalanság a licencdíjakkal kapcsolatban, a szakértők elmozdulhatnak a CRISPR/Cas9-től, legalábbis amikor a potenciális kereskedelmi alkalmazásokkal kapcsolatos kutatásokról van szó.

Más lehetőségek kutatása is folytatódik. 2016 tavaszán egy kínai kutatócsoport publikált munkát, amely jelezte, hogy az NgAgo nevű fehérje ugyanazt csinálta, mint a CRISPR/Cas9, még jobban. De az eredmények korainak bizonyultak. Ahogy az izgalommal történt, felkelt egy lambda Red nevű fehérje, amelynek állítólag van igazi génszerkesztési képessége, és amelyet Zhang, a CRISPR úttörője 14 éven át sok siker nélkül vizsgált.