Összegzés

CÉL: A CT-II, a Nomame Herba kivonat gátló hatásainak vizsgálata in vitro a magas zsírtartalmú táplálékkal táplált patkányok in vitro lipáz aktivitására és elhízására .

TERVEZÉS: A CT-II lipáz aktivitásra gyakorolt ​​gátló hatásának tesztjét a tápközeg CT-II-vel, sertés hasnyálmirigy-lipázzal és trioleinnal történő inkubálása után felszabaduló szabad zsírsavak mérésével végeztük (1. kísérlet). In vivo kísérletek során sovány vagy elhízott patkányokat (570–718 g) 60% zsírtartalmú, magas zsírtartalmú étrendet etettek CT-II-vel vagy anélkül 8 hétig (2. kísérlet), 14 napig (3. kísérlet) vagy 12 hétig. (4. kísérlet), ill.

MÉRÉS: a testtömeg, az ételbevitel, a szervtömeg (a zsír zsír, a máj, a szív és a vese) és a plazma paraméterek (trigliceridek, teljes koleszterin, glükóz, AST, ALT és inzulin), a széklettermelés összes zsírjának és az összes koleszterin időbeli alakulása. mért. Májszövettani vizsgálatokat is végeztek.

Eredmények: A CT-II dózisfüggő módon gátolta a sertés lipáz aktivitását in vitro (1. kísérlet). A test és a máj súlya csökkent, a máj szövettani vizsgálata pedig a zsírmáj javulását mutatta a CT II-vel kezelt állatokban (2. kísérlet). A CT-II dózisfüggő módon szignifikánsan gátolta a testtömeg-növekedést és a plazma trigliceridszint-emelkedést, anélkül, hogy befolyásolta volna a magas zsírtartalmú étrendet fogyasztó sovány patkányok táplálékfelvételét. Az emelkedett plazma AST és ALT szint szintén csökkent (3. kísérlet). Amikor a kövér táplálékkal táplált elhízott patkányokat legfeljebb 6 hónapig CT-II-vel kezelték, a testtömeg kezdetben csökkent, majd a súlygyarapodás jelentősen megszűnt. Az összes testzsír is szignifikánsan csökkent, és a plazma AST és ALT jelentős csökkenését figyelték meg (4. kísérlet).

KÖVETKEZTETÉSEK: Ezek az eredmények bebizonyították, hogy a CT-II lipázinhibitor hatékonyan megelőzi és enyhíti az elhízást, a zsírmájat és a hipertrigliceridémiát magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban.

Hozzáférést a

Bevezetés

A hasnyálmirigy-lipáz a legfontosabb enzim a trigliceridek emésztéséhez az étrendben. 1 A lipáz inhibitor alkalmazását korábban az elhízás kezelésének tárgyát képezték. Az Orlistat (Ro 18-0647), a Streptomyces toxitricini-ből származó hidrogénezett lipsztatin-származék, a gyomor, a hasnyálmirigy és a karboxilészter lipáz 2 erős gátlója, és bebizonyosodott, hogy hatékony az emberi elhízás kezelésében. 3, 4, 5 A lipázinhibitorok létezését különféle élelmiszeripari termékekben vizsgálták, és ezeknek az inhibitoroknak a jelenlétéről beszámoltak gabonafélékben, búzakorpában és búzacsírában 6, valamint a szójababban 7, 8. A lipázinhibitorokat olyan természetes termékekben is keresik, mint a kínai gyógyszerek és a különféle gyógynövények. 9.

Hüvelyes növény, Cassia mimosoides L. var. nomino Makino (Nomame Herba), Japánban és Kínában termesztik, és Japánban hagyományosan teaként fogyasztják. A természetes termékek közül a lipázinhibitorok kiválasztása során a Nomame Herba kivonata figyelemre méltó gátló hatást mutatott a lipázra. Jelen tanulmányban ennek a kivonatnak, a CT-II-nek az in vitro lipázaktivitásra és az elhízás elleni hatásokra gyakorolt ​​gátló hatását vizsgálták in vivo magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányokban. .

Mód

A CT-II előállítása

A CT-II a Nomame Herba vizes etanol-kivonatának egy része, amely főleg proantocianidint (sűrített tannin) tartalmaz. A frakció elkészítése a következő volt: 800 g száraz növény légi részét extraháltuk 10 liter 50% -os etanollal (4 liter, 3 liter, 3 liter, három extrakcióval). Az extraktumot Diaion HP 20 oszlopnak vetjük alá (Mitsubishi Chemical Corporation), 30% etanollal mossuk és 80% etanollal eluáljuk. Az eluált oldatot bepároljuk és liofilizáljuk szárazra, majd 24 g CT-II port kapunk. CT-II port használtunk keverékként in vivo kísérleti étrenddel .

A CT-II in vitro gátló hatása a lipáz aktivitására

A lipáz aktivitás vizsgálatot trigliceridek szubsztrátként történő alkalmazásával Fukumoto és mtsai. 10 Összefoglalva, a (pH 7, 4) és 1 ml tetrahidrofurán (THF) 50% -os CT-II oldat gátló hatását összekevertük egy L típusú kémcsőben (~ 18 × 120 mm) és 1 ml sertés hasnyálmirigy-oldatban. Ezután lipázt (Sigma II típus, 0,71 mg/ml fehérjeként McIlvaine pufferben) adunk hozzá, és 37 ° C-on 15 percig rázással inkubáljuk. A reakciót etanol hozzáadásával leállítottuk, és a felszabadult zsírsavakat 0,05 M NaOH-oldattal titráltuk. A vakot 50% THF alkalmazásával mértük CT-II nélkül (1. kísérlet).

A CT-II testtömegre, testzsírra és metabolitokra gyakorolt ​​in vivo hatása

Állatok és étrend.

Nőstény Sprague-Dawley patkányokat használtunk a vizsgálatban. Különálló rozsdamentes acél ketrecekben tartották őket ellenőrzött hőmérsékleten (24 ± 2 ° C) és 12 órás világos/sötét ciklusban, szabadon hozzáférve a vízhez és magas zsírtartalmú porított étrendhez, amely 60% zsírt, 7,5% szénhidrátot, 24,5% fehérje (6,7 kcal/g), mint az előző vizsgálatban. 11 A főleg zsírtalanított szójalisztet és hallisztet tartalmazó normál étrendet extrudált étrendnek nevezik (CE-2, Clea Japan Inc.).

Eljárások.

A CT-II kezdetben lipázgátló hatást mutatott az in vitro vizsgálatban. Mivel a túlzott étkezési zsírbevitel hozzájárul az elhízás kialakulásához, a kivonat megelőző hatásait az elhízás kialakulására magas zsírtartalmú étrenddel etetett patkányokban vizsgálták. Miután alkalmazkodtunk a magas zsírtartalmú étrendhez és a laboratóriumi körülményekhez 1 hétig, a 239-251 g tömegű sovány patkányokat két csoportra osztottuk. A kontrollcsoport csak a magas zsírtartalmú étrendet kapta; A másik csoport magas zsírtartalmú étrendet kapott, 2,5% -os koncentrációban kevert CT-II-vel. A testtömeg minden héten mérésre kerül. 8 hetes CT-II kezelés után az állatokat leöltük, megmérettük a szervek súlyát, és a szerveket szövettanilag vizsgáltuk (2. kísérlet).

Ezután megvizsgálták a CT-II dózis testtömegre és plazma metabolitokra gyakorolt ​​hatását patkányokban. A 265–298 g tömegű sovány patkányokat hat csoportra osztották. A kontrollcsoport csak a magas zsírtartalmú étrendet kapta, mint a 2. kísérletben. A másik öt csoport magas zsírtartalmú étrendet kapott, CT-II-vel keverve 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,5% és 3,5% koncentrációban. A testsúlyt a CT-II kezelés megkezdése után 4, 7, 11 és 14 napon mértük, és a napi táplálékfelvételt a 2 hetes kezelési periódus alatt mértük. Ezt követően 12 órás böjt után vért vettek a nyaki vénából. A mintákat centrifugáltuk, a plazmát elválasztottuk és a vizsgálatig fagyasztottuk. A plazma triglicerideket (TG), az összes koleszterint (TC), a glükózt, az aszpartát-aminotranszferázt (AST, EC 2.6.1.1) és az alanin-aminotranszferázt (ALT, EC 2.6.1.2) mértük az alábbiakban a "Vizsgálatok" részben leírt eljárásokkal (3. kísérlet). .

Végül értékelték, hogy a CT-II képes-e csökkenteni az elhízást a magas zsírtartalmú étrendet tápláló patkányokban. Azokat a patkányokat, amelyekben az 570–718 g tömegű, magas zsírtartalmú étrend elhízást váltott ki, két csoportra osztottuk. A kontrollcsoport (átlagos testtömeg, 643 g) továbbra is csak ezt az étrendet kapta. A második csoport (átlagos testtömeg, 641 g) magas zsírtartalmú étrendet kapott 2,0% -os koncentrációban kevert CT-II-vel. A testtömeget hetente mértük. 4 hetes kezelés után 3 napig mértük a táplálékfelvételt, az összes zsír széklettermelést és az ürülékben lévő összes koleszterint. 12 hetes kezelés után 12 órás éhezés után vért vettünk a szívből, a plazmát elválasztottuk és a vizsgálatig fagyasztottuk (TG, TC, glükóz, AST, ALT és inzulin; 4. kísérlet).

esszék

A glükózt glükóz-oxidáz módszerrel elemeztük. Az összes koleszterint (TC), a triglicerideket (TG), az aszpartát-aminotranszferázt (AST) és az alanin-aminotranszferázt (ALT) száraz kémiai autoanalizátorral (AU-5200, OLYMPUS) elemeztük. Az inzulint immunológiai vizsgálattal határoztuk meg. 12 Szervi súlyt (parametrikus zsír, máj, szív és vese) mértünk és feljegyeztünk a végső testtömeg százalékában, az abszolút értékekkel együtt. Az összes tetemzsírt úgy határoztuk meg, hogy liofilizált homogenátumot vontunk ki a hasított testből bőr nélkül. A tetemet megnyúzták, és a bőrre tapadt bőr alatti zsírt éles késsel vagy spatulával lekaparták. A bőr nélküli tetemet és a szubkután zsírt egyesítettük és homogenizáltuk, kétszer egy húsdarálón (Meat Mincer β10, BONNY Inc.) átfuttatva 3,2 mm-es hálós lemezzel, majd liofilizáltuk. A bőr nélküli hasított test liofilizált homogenizátumának lipid-extrakcióját a Folch 13 módszerével hajtottuk végre, és az extraktumokat vákuumban bepároltuk, és lemértük. A teljes zsírtartalmat abszolút értékként és a végső testtömeg százalékában számítottuk.

Statisztikai elemzés.

Az adatokat átlag ± se-ként fejeztük ki, és Student és Aspin-Welch ANOVA elemzésével elemeztük, vagy adott esetben megismételtük az egyirányú ANOVA mérését; P értéke

kivonat

A CT-II hatása a lipáz aktivitására. A lipáz aktivitást sertés hasnyálmirigy lipáz és triolein alkalmazásával szubsztrátként mértük. A gátló hatást a kontroll relatív aktivitásának (%) és a lipáz aktivitás (0 mg/ml CT-II) csökkenésének mutatták.

Teljes méretű kép

A 2. ábra a zsírtartalmú étrendet CT-II-vel vagy anélkül tápláló sovány patkányok testtömeg-növekedésének sebességét mutatja (2. kísérlet). A 2,5% CT-II tartalmú étrendet fogyasztók nyeresége szignifikánsan elnyomódott 1-8 hétig a kezelés alatt (P

A CT-II hatása a testtömeg-gyarapodásra sovány patkányokban, amelyek magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak. Az értékek az átlag ± se (%) (n = 6). A testtömeg-növekedés változását az egyes kezelési periódusokban a kiindulási testtömeg százalékában adják meg. (•) ellenőrzés; (▴) CT-II 2, 5% étrendben. *** Jelezzen szignifikáns különbségeket a Student t-tesztben és az Aspin-Welch-ben, amelyek összehasonlítják a CT-II csoport 2,5% -át a kontroll csoporttal (a CT-II 0% -a) (* P

A májszövettan összehasonlítása sovány patkányokon, amelyek magas zsírtartalmú étrendet fogyasztottak 8 hét CT-II kezelés után. Számos zsírcseppet, amelyek nagy fehér gömbök voltak a kezeletlen kontrollokban, eltávolították vagy méretük csökkent.

Teljes méretű kép

A magas zsírtartalmú étrendet CT-II-vel és anélkül tápláló patkányok testtömeg-növekedésének dózisfüggő hatásait a 2. táblázat mutatja be. A CT-II dózisfüggő módon elnyomta a testtömeg-növekedést. Az 1,0–3,5% CT-II tartalmú étrendet tápláló négy csoport súlygyarapodási aránya szignifikánsan elnyomódott (P

A CT-II hatása a testtömeg-gyarapodásra elhízott patkányokban, magas zsírtartalmú étrendben Az értékek az átlag ± se (%) (n = 6). A testtömeg-növekedés változását az egyes kezelési periódusokban a kiindulási testtömeg százalékában adják meg. (•) ellenőrzés; (▴) CT-II 2,0% étrendben. *** Jelölje a Student t teszt és az Aspin-Welch közötti szignifikáns különbségeket, amelyek összehasonlítják a CT-II csoport 2,0% -át a kontroll csoporttal (a CT-II 0% -a) (* P 2.14, és kimutatták, hogy anti -obesz és antihiperkoleszterinémiás aktivitás különböző állatmodellekben (15, 16 és emberben) 3, 4, 5 Beszámoltak arról, hogy a lipázaktivitás 50% -os gátlása 0,63-0,0, 85-0,1 μg/ml részlegesen tisztított sertés hasnyálmirigy lipáz egy lipáz vizsgálati rendszerben

A 2. kísérletben a CT-II beadása gátolta a testtömeg-növekedést a sovány patkányoknál, amelyek dózisfüggő módon táplálták a magas zsírtartalmú étrendet. Ez a gátlás nem függött a táplálékbevitel csökkenésétől, mert nem volt különbség az elfogyasztott táplálék mennyiségében a CT-II-vel kezelt és a CT-II-vel nem kezelt patkányok között. A plazma TG szintén csökkent az adagtól függően. Az AST és az ALT 2 hét CT-II kezelés után csökkent, a máj szövettana 2 hónapos kezelés után javult a zsírmájban. Az eredmények azt is bizonyították, hogy a CT-II kezelés megakadályozta a zsírmájat.

A 4 hetes kezelés után a bevitt zsír és az ürülékkel kiválasztott zsír közötti egyensúlyi teszt növekedését mutatta, ami arra utal, hogy a CT-II gátolja az intragasztrointesztesztinális lipázt, ami a hidrolízis elnyomásából és a trigliceridek felszívódásából származott volna. in vitro mutatták ki. Ezért a hasnyálmirigy lipáz aktivitásának gátlását in vivo is bizonyították. A koleszterin kiválasztása a székletben szintén növekedett. A THL gátolja a koleszterinészteráz és a lipáz aktivitását. Ezért fennáll annak a lehetősége, hogy a koleszterin II-koleszterin CT-II általi gátlását a koleszterin gátlása elnyomja. A CT-II azonban nem csökkentette a plazma koleszterinszintjét, bár növelte a koleszterin kiválasztódását a székletben, ezért további kutatásokra van szükség ezen megfigyelés megértéséhez.

A THL lipázinhibitor káros hatása a hasmenés nagyon gyakori előfordulása az embereknél. 3, 5 A jelen vizsgálatban CT-II-vel kezelt patkányok azonban nem mutattak hasmenést vagy rendellenes vérkémiát, ami arra utal, hogy az extraktumnak kevesebb káros hatása van, mint a THL-nek.

Összefoglalva: a lipáz inhibitor CT-II hatékony volt az elhízás, a zsírmáj és a hipertrigliceridémia megelőzésében és enyhítésében magas zsírtartalmú étrenddel táplált patkányokban. Az eredmények arra utalnak, hogy a CT-II hasznos anyag lehet az emberek elhízásának és hipertrigliceridémiájának megelőzésében és kezelésében.