Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Az elhízás a zsír túlzott raktározása a szervezetben, amely a metabolikus szindróma, a magas vérnyomás, a cukorbetegség, a diszlipidémia és a zsíros májbetegség egyik fontos eleme, amely növeli a szív- és érrendszeri betegségek kockázatát 11. Míg széles körben elfogadott vélemény, hogy az SFA mint csoport elősegíti a hasi elhízást, a diszlipidémiát, az inzulinrezisztenciát, a csökkent glükóz toleranciát és a szisztémás gyulladást, 12 az SFA ezen szerepe az elhízásban, a cukorbetegségben és a szív- és érrendszeri betegségekben vitatott. A legújabb tanulmányok azt sugallják, hogy az SFA által kiváltott válaszok a lánc hosszától függenek, a laurinsav és a palmitinsav közötti biológiai válaszokban egyértelmű különbségek vannak 13. Az SFA szerepe azonban az egyéni étrendben az OA-ban még nem volt egyértelműen meghatározva.

Korábbi tanulmányaink arról számoltak be, hogy fiatal hím Wistar patkányokban 16 héten át a magas szénhidráttartalmú és magas zsírtartalmú étrend (H, amely elsősorban fruktózt és marhahúsi faggyút tartalmaz) utánozza az emberi metabolikus szindróma tüneteit, beleértve a hasi elhízást is, az összes testzsír növekedését., megemelkedett plazma lipid- és vérnyomás, csökkent glükóz tolerancia és inzulinérzékenység, zsírmáj és kardiovaszkuláris átalakulás 14. Jelen tanulmány az SFA szerepét vizsgálta C12-től C18-ig (laurinsav (LA; C12: 0), mirisztinsav (MA; C14: 0), palmitinsav (PA; C16: 0) és sztearinsav (SA; C18): 0), valamint a marhafaggyú (főleg transz-zsírsavak és transz-zsírsavak) mind a metabolikus szindróma jelei, mind az OA kialakulása esetén.

Eredmények

SFA metabolikus szindrómában

A magas szénhidráttartalmú étrendet és a telített és transz-zsírt egyaránt tartalmazó marhafaggyúval együtt (H diéta) az emberi metabolikus szindrómához kapcsolódó változások alakultak ki, beleértve a hasi elhízást, a hiperleptinémiát, a hiperlipidémiát és a májműködési zavarokat a kukoricakeményítő étrendhez (C diéta) képest ( 1. táblázat), azonban a H patkányok nem mutattak hiperglikémiát és hiperinsulinémiát a C patkányokhoz képest A C étrend alacsony energiasűrűségű, és valószínűleg emiatt a táplálékfelvétel nagyobb volt a C patkányokban, mint az összes többi csoportban. Bár a C-patkányoknál magasabb volt a táplálékfelvétel, az összes magas zsírtartalmú étrendcsoportban az energiafogyasztás magasabb volt, mint a C-patkányokban, C

metabolikus

( NAK NEK ) A teljes patkány térdízületek és rekonstruált axiális mikro CT (inzert) keresztmetszeti képek háromdimenziós képei az érdeklődési körzetről, azaz a mediális és laterális sípcsont platóról, amely megváltozott szubkondrális csontépítészetet mutat (a sárga nyilak kóros csontokat mutatnak) morfológiai változásokat) . A morfometriai elemzésekhez ( B ) A csonttérfogat-frakciót (BV/TV) a szegmentált csonttérfogat (BV) és a kérdéses régió teljes térfogatának (TV) arányaként számítottuk ki. Mi több, ( C ), a kérdéses régió csontásványi sűrűségét (BMD) is kiszámítottuk. Valamennyi érték átlag ± SD (P 2 (Átl.OS.L)) növekedést mutat a H, HPA és HSA patkányokban a C patkányokhoz képest, ami a csontok átalakulásának növekedését és a diéták által szabályozatlan ásványi anyagcserét sugallja. A HLA és HMA patkányok OS.L sűrűsége nagyon hasonló volt a C patkányokéhoz.A H, HMA, HPA és HSA patkányokban az átlagos oszteocita mag (Avg. OS.N) alacsonyabb jelenléte a C patkányokkal összehasonlítva arra utal, hogy a diéták az osteocyták apoptotikus halálát idézik elő (2. kiegészítő táblázat).

SFA emberi kondrocitákban és szarvasmarha-porc explantánsokban

( NAK NEK ) EGY DOBOZ, ( B COL10A, ( C ) MMP13, ( D ADAMTS4, ( ÉS ) ADAMTS5 és ( F ) A RUNX2 mRNS szintjét RT-PCR-rel értékeltük mind IL-1β nélküli betegeknél, mind IL-1β pelleteknél. Az összes kísérleti mintát három példányban hajtottuk végre. Valamennyi érték átlag ± SD (P

A vizsgálat korlátai közé tartozik, hogy nem mértük a szinoviális morfológiai változásokat vagy a citokinek koncentrációjának változását a szinoviális folyadékban. Ez a két további paraméter további információkkal járulhat hozzá ahhoz, hogy megértsék az AGS-diéták gyulladásából eredő lokális változásokat, és ezáltal javítsák az elhízás okozta OA megértését.

Összefoglalva, ez a tanulmány bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az SFA hasonló változásokat okozhat mind a metabolikus szindrómában, mind az OA-ban. Ezek a változások korrelálnak a leptin és az inzulin plazmakoncentrációival, mindkettő szerepet játszik az elhízásban, a 2-es típusú cukorbetegségben és az OA-ban. Adataink arra utalnak, hogy a kókusz eredetű LA-t tartalmazó hagyományos étrend pálmaolajból származó PA-val vagy állati zsírból származó SA-val való helyettesítése ronthatja a metabolikus szindróma és az OA kialakulását. Ezenkívül humán klinikai vizsgálatokra van szükség annak megállapításához, hogy a PA és az SA étrendben történő LA-val történő helyettesítése gyengíti-e vagy visszafordítja-e az OA és a metabolikus szindróma, különösen az elhízás és a magas vérnyomás kialakulását.

Mód

Tervezési tanulmány és diéták.

Metabolikus változók mérése.

A patkányok napi egészségi állapotának figyelemmel kísérése érdekében napi méréseket végeztek a testtömegről, valamint a táplálék és a víz beviteléről. A takarmány-konverzió hatékonyságát (%) a korábban leírtak szerint számítottuk [14]. A 16 hetes testtömeg-növekedés százalékát a 0. és a 112. nap közötti testtömeg-különbségként számoltuk ki. A hasi kerületet 4 hetente mértük egy szokásos mérőszalaggal, könnyű altatásban, Zoletil alkalmazásával (tiletamin 10 mg/kg, zolazepam 10 mg/kg ip); Virbac, Peakhurst, NSW, Ausztrália).

A patkányokat 16 hét után Lethabarb®-nal (100 mg/kg nátrium-pentobarbiton, ip) elpusztítottuk. Az eutanázia után a plazma izolálásához vért gyűjtöttünk, és a plazmát további elemzés előtt -20 ° C-on tároltuk. A szíveket izoláltuk, hogy felkészítsük a Langendorff-szívet az állandó diasztolés merevség mérésére. Ezt követően a szöveteket, például a májat, a bal kamrát (septummal), a jobb kamrát és a hasi zsírpárnákat (beleértve a retroperitoneális, epididymis és omentális elemeket) eltávolítottuk mérés céljából, és mg/mm tibialis hosszban fejeztük ki. A leptin, az inzulin, az összes koleszterin, a trigliceridek és a nem észterezett zsírsavak (NEFA) plazmakoncentrációit a korábban leírtak szerint mértük [14] .

Az ízületi porc értékelése.

TUNEL apoptózis vizsgálata

A terminális dezoxinukleotidil-transzferázt (TdT) dUTP Nick-End Labelinget (TUNEL) alkalmaztuk olyan sejtek azonosítására, amelyek apoptózis során mutatják a DNS degradációját. A szövetszeleteket először proteináz K-val 30 percig permeabilizáltuk 37 ° C-on. A tárgylemezeket PBS-sel mostuk, és a vizsgálatot a gyártó (Roche, Németország) protokolljának megfelelően végeztük. A metszeteket pozitív kontrollként 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk DNase1-gyel. A félkvantitatív adatok elemzéséhez a különböző megfigyelési mezőkből származó pozitív sejteket megszámoltuk, és az ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 39 alkalmazásával minden csoport 100 sejtjére jutó sejtek számára normalizáltuk. .

A subchondralis csontelváltozások értékelése.

A subchondralis csontelváltozások elemzésére mikro-CT-t végeztünk. A combcsontot és a sípcsontot mikro-CT (Scanco μCT 40, Scanco Medical, Svájc) segítségével vizsgáltuk, 18 μm izotrop voxelmérettel, 55 kV feszültséggel és 145 μA árammal, alumínium szűrővel 0, 5 mm . Az expozíciós idő 1180 ms volt, és a Scanco beágyazott szoftverét használták a 39 adatkészlet szegmentálására. Manuális érdeklődésre számot tartó régiókat (ROI) rajzoltunk az anatómiai kontúr köré a szubkondrális csont régiójában a mediális és laterális tibialis fennsíkon. Az érdekes mennyiség (VOI) egy ROI stackből állt (25 szakasz). A VOI a subchondralis lemez alatt kezdődött, disztálisan a növekedési lemez felé nyúlik. Kiszámítottuk a csonttérfogat és az össztérfogat (BV/TV) és a VOI csontásványi sűrűség (BMD) kapcsolatát.

Osteocita elemzés.

Az üres osteocyta-hézagok (Avg OS.L) és az átlagos osteocyta-mag (Avg OS.N) átlagát egységnyi területre (mm 2) számoltuk a medialis tibialis fennsíkon található subchondralis csont régiójában ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

A kondrociták és a porc explantánsok kezelése SFA-val

SFA előkészítés

LA-t, MA-t, PA-t és SA-t a lehető legnagyobb tisztaságban (Sigma-Aldrich, GC-vel tisztítva, kémiailag szintetizálva) vásárolták meg a kereskedelemben. A vivőanyagként a szarvasmarha szérum albumint (BSA) (zsírsavaktól mentes, Sigma Aldrich) választottuk. Az SFA-BSA komplex megoldásait egy korábban leírt protokoll alkalmazásával hajtottuk végre [6]. Az egyes SFA-kat 100% etanolban oldjuk 70 ° C-on, így 200 mM törzsoldatot kapunk. A törzsoldatot ezután 1: 10 arányban 10% (w/v) BSA-ban hígítottuk Dulbecco módosított Eagle táptalajával (DMEM) 10 percig 55 ° C-on. A kapott SFA-oldatot (20 mM) sterilen (0,45 µM szűrő) szűrtük. ) a sejtkultúrákra történő alkalmazás előtt, egy korábban leírt protokoll alkalmazásával [6]. A vivőanyag-kontroll (negatív kontroll) zsírsavmentes BSA volt, azonos etanol-koncentrációval.

Kondrocita tenyészet és szarvasmarha-explantánsok.

A kondrocitákat enzimatikus emésztéssel gyűjtöttük össze, és tenyésztettük publikált protokolljaink 39 segítségével. Röviden: az ízületi porc biopsziáit olyan primer OA-betegektől nyertük, akik térdprotézis műtéten esnek át a Prince Charles Kórházban (Brisbane, QLD, Ausztrália). Az összes porcbiopsziát a combcsont felszínének egy részéből vették, amelyet a sebész úgy vél, hogy ép és egészséges porcra hasonlít. Az öt donor 60–65 éves férfi volt, és írásos beleegyezésüket adták. A tanulmányt a Prince Charles Kórház és a Queenslandi Műszaki Egyetem Humánetikai Bizottsága hagyta jóvá. Mindegyik porcmintát tovább jellemeztük és pontoztuk Mankin-pontszám szerint, további kísérletekhez csak 0–1 (egészséges porc) pontszámú mintákat használtunk.

A porcot boncoltuk a csontból, és egy éjszakán át emésztettük kollagenáz 2 oldattal (Invitrogen, Lakewood, NJ) DMEM táptalajban az izületi porc kondrociták (ACC) izolálása céljából. Emésztés után az ACC-ket (2,5x105 sejt) centrifugálással 15 ml-es Falcon-csövekben pelletáltuk és háromdimenziós (3D) pellettenyésztrendszerben 39 tenyésztettük 14 napig kondrogén táptalajban, különböző SFA jelenlétében vagy hiányában.

A szarvasmarha-explantatív vizsgálatokhoz friss felnőtt szarvasmarha-térdízületeket (n = 3) nyertek a vágás napján. Ezután teljes vastagságú ízületi porc explantátumokat szedtek a subchondralis csont nélkül a térdízületekből. Ezután a porckorongokat aszeptikusan boncoltuk 4 mm-es dermális lyukasztóval. A lemezeket DMEM-ben tenyésztettük, és kiegészítettük 10% -os szarvasmarha-magzati szérummal (FBS) és antibiotikumokkal 37 ° C-on, 5% CO 2 -val 48 órán keresztül.

A pelleteket és a korongokat ezután minden egyes SFA-val stimuláltuk (végső koncentráció: 30 μg/ml, MTT assay-ből származtatva - az adatok nem láthatók). A negatív kontrollt, amelyhez SFA-t nem adtunk, csak BSA hordozóval kezeltünk. Az SFA és a gyulladásos citokinek hatásainak tanulmányozásához néhány ACC-pelletet és szarvasmarha-porckorongot IL-1β-val (10 ng/ml) kezeltünk különböző SFA jelenlétében vagy hiányában. A 3. és a 7. nap után a táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk a szulfatált glikozaminoglikánok mennyiségi meghatározása céljából. A porckorongokat és az ACC-pelleteket később szövettani elemzéshez és kvantitatív valós idejű PCR-analízishez (qPCR) dolgoztuk fel. Az egyes SFA-kra adott válaszok további értékeléséhez különböző koncentrációkat (10 μM, 30 μM, 60 μM és 90 μM) adtak a kondrocita pelletekhez IL-1β (10 ng/ml) hiányában és jelenlétében (10 ng/ml). ). A 3. és a 7. nap után a táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk a szulfatált glikozaminoglikánok (sGAG) mennyiségi meghatározása céljából. Ezenkívül az ebben a vizsgálatban alkalmazott IL-1β hatásainak értékeléséhez a kondrocita pelleteket különféle IL-1β koncentrációkkal (1-10 ng/ml) kezeltük. A 3. és a 7. napos táptalajokat összegyűjtöttük és -80 ° C-on tároltuk az sGAG mennyiségi meghatározása céljából.

Szulfatált glikozaminoglikánok (sGAG) vizsgálata

Az sGAG-felszabadulás mérése céljából a felülúszókat a szarvasmarha-porckorongokat vagy kondrocita-pelleteket tartalmazó üregekből gyűjtöttük, amelyeket SFA-val vagy anélkül kezeltünk a 3. és a 7. napon. Biocolor Ltd) a gyártó utasításainak betartásával. A porc explantánsokban az sGAG kimerülésének zónáját a Safranin O festés képeivel határoztuk meg, és ImageJ (NIH, Bethesda, MD) alkalmazásával mértük.

RNS extrakció és valós idejű PCR

A teljes RNS-t TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával extraháltuk, DNase-sel kezeltük és a gyártó protokolljának megfelelően RNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával tisztítottuk. A cDNS-t a teljes RNS 1 μg-jából szintetizáltuk a gyártó protokollja szerint, SensiFAST cDNS Synthesis Kit segítségével. Valós idejű kvantitatív PCR 41-et SYBR Green detektálási kémia alkalmazásával az ABI 7500 Fast Real Time PCR rendszeren (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Az összes valós idejű PCR-termék olvadásgörbe-elemzését elvégeztük, és kimutattuk, hogy egyetlen DNS-duplexet állítunk elő. Az összes mintát három példányban mértük, és az összes kísérleti minta átlagértékét figyelembe vettük az összehasonlító elemzéshez. Az ebben a vizsgálatban használt összes primer kvantitatív mérését a (2 -ΔΔ Ct) módszerrel határoztuk meg, belső kontrollként pedig 18 s és β-aktin expressziót használtunk, amint azt 39., 41., 42., 43. csoportunk korábban leírta. .

Statisztika

A statisztikai elemzéseket a Graphpad Prism alkalmazásával végeztük. Az adatokat az összes változó átlag ± standard deviációjaként (SD) mutatjuk be, és ANOVA módszerrel elemezzük. A statisztikai szignifikancia értékeléséhez ismételt mértékű varianciaanalízist alkalmaztunk post hoc tesztekkel (Dunnett's/Bonferroni). A szignifikancia szintjét P-re állítottuk