Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Betegek és szérumok

Fehérjekivonások

50 mg/s teljes fehérjéket extraháltunk a B. distachyon Bd21 vonalának tiszta, aprított magjából Dupont és mtsai. 13 protokollja szerint. Röviden: egy 2% SDS-t, 10% glicerint, 50 mM DTT-t és 40 mM Tris-HCl-t (pH 6,8) tartalmazó SDS-Tris extrakciós puffert (pH 6,8) alkalmaztunk a teljes fehérje extrahálásához szobahőmérsékleten egy órán át, rendszeres enyhe dózis. örvény. Az extraktumot 16000 g-vel 15 percig centrifugáltuk. A felülúszót négy térfogat jéghideg acetonnal kicsapjuk. Öt biológiai másolatot alkalmaztunk az extrakciós folyamatban.

2D gélelektroforézis és immunblotolás

Csapás után az üledéket IEF pufferrel (8 M karbamid, 2% CHAPS, 100 mM DTT, 0,2% CA és 0,1% bróm-fenol kék) oldjuk. Az izoelektromos fókuszálást 7 cm-es Immobiline DryStrips pH 7-10-ben (GE Healthcare) hajtottuk végre, rehidratációs körülmények között, egy éjszakán át 200 ug fehérjével és 150 µl IEF pufferrel. 12% poliakrilamid géleket alkalmaztunk a fehérjék molekulatömegük szerinti szétválasztására. A 2D GE-t három technikai másolatban készítettük. Mivel a különböző biológiai és technikai replikákból származó 2D fehérje minták megegyeztek, a végső inline nano-LC-MS/MS-t három 2D GE technikai replikából hajtottuk végre, és a foltokat egyesítettük.

Miután a GE 2D fehérjéket átvitték az ImmobilonP PVDF membránra (Millipore, Billerica, USA), és 1 órán át blokkolták 5% BSA-val és 0,05% TWEEN20-mal, majd egy éjszakán át inkubálták 4 ° C-on, 1:20 hígított vérszérummal. Az immunreaktív fehérjéket kecske anti-humán IgA peroxidáz konjugált antitesttel (Sigma-Aldrich-A0295) detektáltuk kromogén peroxidáz szubsztrát 4-klór-1-naftol jelenlétében. Az immunválasz fehérjefoltokat kivágtuk és fehérje-azonosítás céljából online nano-LC-MS/MS alkalmazásával elküldtük. Rizs glutelin antitestet és nyúl anti-IgA másodlagos antitestként alkalmaztunk a 2D Western blot analízisben a vetőmagot tároló globulinok jelenlétének megerősítésére 14 .

Fehérje-azonosítás nano-LC-MS/MS segítségével online

Szekvenciaelemzés és epitóp-előrejelzések

Eredmények

globulin

( NAK NEK ) - A beltenyésztett Bd21 vonal teljes fehérjekivonatának 2D gélelektroforézise. A fehérjéket 3-10 pH-értékű IPG-csíkokon választottuk szét, majd 12% -os akrilamid-géleken. A jelölt fehérje foltok immunreaktív fehérjéket képviselnek, és beküldtük on-line nanoLC-MS/MS elemzésre. A molekulatömeg-tartomány a bal oldalon van jelölve. ( B nak nek F ) - reprezentatív immunblotok naiv cöliákiás betegek IgA-reaktív szérumainak felhasználásával ( B - HLA DQ2, C - HLA DQ8, D - HLA DQ8/X), a terápia Crohn-kórban szenvedő ileokolikus betegeket érintett ( ÉS ), HLA DQ2 lisztérzékenységben szenvedő beteg gluténmentes étrendben és egészséges kontrollban ( G ). H: A teljes fehérjekivonat Western blot-analízisét rizs-glutelin 12-vel és nyúl-ellenes IgA antitestekkel (Sigma-Aldrich) alkalmaztuk másodlagos antitestként.

Teljes méretű kép

Teljes méretű asztal

Két 7S globulint (Uniprot ID I1GPS5 és I1GMC8) főleg a foltokból azonosítottak. Az I1GPS5-et 14 fehérjepont elsődleges találataként ismerték el. Ez a fehérje mutatta a legnagyobb hasonlóságot a Globulin-3 és a Globulin-3A búzatároló fehérje homológjaival (Uniprot ID B7U6L4 és I6QQ39). Az I1GMC8-at két fehérjefoltban azonosítottuk, és a legnagyobb szekvencia-hasonlóságot mutatta a Triticum urartu-ból (M7ZQM3) azonosított Globulin 1S-szerű fehérjével. Az I1HNH9 Brachypodium fehérje mutatta a legnagyobb homológiát egy 11S globulinnal (A. sativa Q38780). Az I1HMK7 és I1IPF2 fehérjéket 12S globulinként azonosítottuk, a legnagyobb hasonlóságot mutatva az A. sativa 12S magtároló fehérjéivel (P12615 és P14812). A szérum gyakrabban reagált a Globulin-3A (69,23% - I1GPS5) búzatároló fehérje és a 11S és 12S típusú globulinok (76,92% - I1HNH9 és I1HMK7) homológjára. Az alacsony molekulatömegű gluteninnel (69,23% I1HMR6) hasonló homológ szintén rendkívül reaktív immunrendszer volt a lisztérzékenységben szenvedő betegek szérumaival szemben.

A vetőmagot tároló globulinok jelenlétének tesztelésére az immunreaktív fehérje foltokban Western-blot-analízist végeztünk a rizs glutelinekre specifikus elsődleges antitestekkel, a 11S magot tároló globulinok rizs homológjaival (1H ábra). Erős globulin jeleket detektáltunk az ID 1–14 és 22–28 fehérjefoltokról.

A legfontosabb globulin találatokat (I1GPS5, I1GMC8, I1HMK7, I1IPF2 I1HNH9), valamint a leggyakrabban azonosított prolamin fehérjét (I1HRM6) struktúra-előrejelzésnek vetettük alá in silico szekvencia elemzés alapján. Két jellegzetes szomszédos cupin-1 domént találtunk a 7S és 11S-12S magtároló globulinokban az összes Brachypodium globulin találatnál (2. ábra). Az elemzett globulin fehérjék nagy részében 22 olyan régiót találtunk, amely potenciálisan képes kötődni a társult strukturált fehérjékhez. Az erős kötő régiók a rendezett rendezetlen régiók határán helyezkedtek el a 7S típusú globulinokban (I1GPS5 és I1GMC8), míg a 11S és 12S globulinokban szignifikánsan gyengébb kötő régiók találhatók, és az elemzett Brachypodium prolaminban nem volt kötő régió . sorrend. (2. ábra)

Teljes méretű kép

Tíz hosszú aminosav-peptidet azonosítottunk, amelyek szekvenciája meghaladja a 70% -os szekvenciát a B-sejt-specifikus lineáris glutén epitópokkal az I1GPS5 fehérje-kötő régiók közvetlen közelében (2. táblázat). Az azonosított epitóp-homológok peptideket reprezentáltak polyQ szakaszokkal, és a fehérje két glutaminban gazdag régiójában helyezkedtek el. Ezenkívül hat maradék peptidet (QPEQPF) azonosítottak a 11S magtároló globulinban, az I1HNH9-ben. Ez a peptid egy ismert immunreaktív AGA-specifikus B-sejt QPQQPF epitóp (IEDB Epitope ID 147232) deamidált változata volt, amelyet a lisztérzékenység során dezaminálnak. Ez a kötetlen változat a szérum DGP antitestek egyik elsődleges célpontja a lisztérzékenységben. Érdekes módon az I1HNH9 Poaceae homológok egyike sem tartalmazta ezt a deamidált peptidet. Az anyagcserével kapcsolatos fehérjékben epitóp-homológokat nem találtak.

Teljes méretű asztal

Az előrejelzett kötőanyagok kiválasztását 1% -nál nagyobb kötőanyagok alkalmazásával végeztük a konszenzus percentilis rangértékek alapján. Az előrejelzéseket minden allélra külön-külön számoltuk ki. Az előre jelzett epitópokat a fehérje szekvenciákhoz térképezzük fel.

Teljes méretű kép

Az I1GPS5 7S globulin monomer harmadlagos szerkezeti modelljét a növényekből izolált 7S globulinok nyilvánosan elérhető kristályszerkezeteinek felhasználásával állítottuk össze. Az azonosított gluténspecifikus B-sejt epitóp homológokat, amelyek egymástól körülbelül 350 aminosavat választják el, strukturális közelségbe térképeztük fel. Az egyik B-sejt-epitóp homológ a második cupin-1 domén által képzett béta hordó külső felületén található. Az előrejelzett HLA-DQ-specifikus T-sejt-epitópok és az azonosított I-es típusú cukorbetegség-epitóp a fehérjemolekula ellentétes helyén helyezkedett el, amely emésztési enzimeknek is ki volt téve (4A, B, C ábra). A 11S magtároló globulin I1HNH9 esetében a megjósolt DQ2 epitóp rejtett helyzetben volt, míg a B-sejt epitóp QPEQPF homológja a fehérje felületén volt (4D és E ábra).

A monomer globulin struktúrákat a nyilvánosan hozzáférhető növényi ortológusok mint strukturális sablonok, valamint az I-Tasser fehérje szerkezet és a funkció előrejelzés szerver segítségével modelleztük. Az azonosított glutén-specifikus B-sejt epitóp homológok és a jósolt HLA DQ2 és DQ8-specifikus T-sejt epitópok helyzetét feltérképeztük a szerkezetbe. ( NAK NEK - C ) I1GPS5; ( D, ÉS ) I1HNH9.

Teljes méretű kép

Vita

Korábbi vizsgálataink alapján nagyszámú gabonamagvak fehérje tartalmazhat prolinban és glutaminban gazdag peptideket, így azok a sejtek célpontjává válnak a lisztérzékenységhez kapcsolódó antigének és a 10, 15, 24 immunoglobulinok jelenlétében. A búzában ezeknek a fehérjéknek a nagy része a prolaminok szupercsaládjába tartozik, és a búzasikér természetes vegyülete. Vannak azonban olyan nem prolamin típusú fehérjék, amelyek peptideket is tartalmaznak, amelyek azonosak vagy nagyon hasonlóak a glutén-specifikus 10,15 T és B sejt epitópokhoz.

Vizsgálatunk megerősítette, hogy a globulin típusú gabonatároló fehérjék specifikusan kapcsolódnak a lisztérzékenységhez, mivel más gyulladásos és immunbetegségekben, például Crohn-betegségben szenvedő betegek nem ismerték fel ezeket a gabonatároló fehérjéket globulin típusúakból. Gluténmentes étrenden élő cöliákiás betegek szérumaival végzett immunblot-analízis kedvezőtlen eredményei szintén megerősítették azt a feltételezést, hogy a magraktározó globulinok másodlagos B-sejt-stimulánsként működhetnek a glutén elsődleges aktivátorai által okozott epitópokkal szembeni erős szekvencia-homológiájuk miatt. A betegség progresszív stádiumában a szőrös atrófia és a megnövekedett béláteresztő képesség hozzájárul ahhoz, hogy ezek a fehérjék keresztantigénekként szolgálhassanak. A szigorú gluténmentes étrenden a cöliákiás betegekből visszanyert bélnyálkahártya megakadályozza a bevitt fehérjék átjutását, és valószínűleg így is szabályozható az erős immunreaktivitás.

A $ config [ads_text16] nem található

Következtetések

további információ

Hogyan idézhetem ezt a cikket: Gell, G. és mtsai. Alacsony prolaminszintű gabonafélék globulin tároló fehérjéinek jellemzése a lisztérzékenység kapcsán. Sci. Rep. 7, 39876; doi: 10.1038/srep39876 (2017).

A szerkesztő megjegyzése: A Springer Nature semleges marad a közzétett térképekkel és intézményi kapcsolatokkal kapcsolatos joghatósági igényekkel szemben.