immunproteasomális

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Az LMP7-hiányos egerek ellenállnak a HFD által kiváltott elhízásnak
  • Az LMP7-hiányos egerek rezisztensek a HFD által kiváltott anyagcserezavarokra
  • Az LMP7 hiánya nincs hatással a táplálékfelvételre, a mozgásszervi aktivitásra és az energiafelhasználásra.
  • Az LMP7 hiánya csökkenti a lipid felszívódást
  • A csontvelő és a nem csontvelő sejtekben található LMP7 hozzájárul az elhízás kialakulásához.
  • Az LMP7 hiány gyengíti a gyulladásos reakciókat a zsírszövetekben.
  • Vita
  • Mód
  • Állatok
  • Mikro-CT elemzés
  • Biokémiai teszt
  • GTT és ITT
  • Szövettan és immunhisztokémia.
  • Valós idejű RT-PCR elemzés
  • BMT kísérletek
  • Légzési gázok és mozgásszervi elemzés
  • Széklet gyűjtése és lipid széklet kivonása
  • Áramlási citometriás elemzés
  • Kísérletek in vitro
  • statisztikai elemzés
  • további információ
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Hozzászólások

Tárgyak

  • Endokrin rendszer és anyagcsere-betegségek.
  • Metabolikus szindróma
  • Elhízottság

Összegzés

Bevezetés

Az elhízás az inzulinrezisztencia, a hiperglikémia, a diszlipidémia és a magas vérnyomás egyik fő kockázati tényezője, metabolikus szindróma néven ismert, és globális közegészségügyi problémává vált. Ezek az anyagcserezavarok növelik a szív- és érrendszeri betegségek és a 2-es típusú diabetes mellitus kockázatát, és hozzájárulnak a megnövekedett halálozáshoz és morbiditáshoz. Bár az elhízás patogenezise összetett és több tényezőt is magában foglal, a legutóbbi tanulmányok kimutatták, hogy a zsírszövet gyulladása kulcsfontosságú kórokozó 1, 2. Valójában az elhízás állatmodelljeiben, valamint metabolikus szindrómában szenvedő elhízott embereknél megfigyelhető a zsírszövetbe történő makrofág infiltráció. Ezek a sejtek jelentik a gyulladásos citokinek/kemokinek, köztük a tumor nekrózis faktor α (TNF-α), az interleukin (IL) -1β és a CC motívum kemokin 2 ligandum (CCL2, más néven protein monocita kemoattraktáns 1) termelésének fő forrását MCP-1]), amely viszont gyulladásos sejteket toboroz, és tovább elősegíti a zsírszövet gyulladását. Azt azonban, hogy a gyulladás hogyan fordul elő és hogyan szabályozódik az elhízás patofiziológiájában, még nem teljesen ismerték.

Eredmények

Az LMP7-hiányos egerek ellenállnak a HFD által kiváltott elhízásnak

Először megvizsgáltuk, hogy az LMP7-hiány befolyásolhatja-e az elhízás kialakulását vad típusú (WT) és LMP7 -/- egerekkel, normál táplálékkal vagy HFD-vel etetve 8 héten keresztül. Bár a WT és az LMP7 -/- egerek között a normál táplálkozási étrendben nem volt szignifikáns különbség a testtömeg-gyarapodásban, az LMP7 -/- egerek testtömeg-gyarapodása szignifikánsan kevesebb volt, mint a magas diétás étrenden fogyasztott WT-egereknél (HFD). 1A). Az epididymális és a szubkután fehér zsírszövet (WAT) tömege drámaian csökkent az LMP7 -/- egerekben, összehasonlítva a WT egerek tömegével (1B. Ábra). Az egyes WAT-ok relatív súlya (szöveti súly/testtömeg) az LMP7 -/- egerekben alacsonyabb volt, mint a WT egerekben (1C. Ábra, máj: 15,9% -os csökkenés, epididymális: 44,7%, mesenterialis: 24,9%, perirenalis: 50,7 % és szubkután: 47,3%). A csökkenés szövettanilag az adipociták méretének csökkenésével magyarázható az epididymális és a szubkután WAT-ban (1D. Ábra, E). A számítógépes tomográfia (CT) elemzése alacsonyabb zsigeri és szubkután zsírtömeget mutatott az LMP7 -/- egerekben, mint a WT egerekben (1F. Ábra, G). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az LMP7 hiány megvéd a HFD által kiváltott elhízás ellen.

( A - C ) TCHO szintek, TG ( NAK NEK ), Vércukorszint ( B ) és a szérum inzulin ( C ) szérumban WT és LMP7 -/- egerekben normál táplálékban és HFD-ben (n = 8–12). ( NAK,-NEK ) GTT eredmények ( D ) és az ITT ( ÉS ) WT és LMP7 -/- egerekben normál táplálékban és HFD-ben (n = 8 mindegyiknél). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki. * p -/- normál táplálékban vagy HFD-ben (3A. ábra) mindkét törzsben megmértük a mozgásszervi aktivitást és az energiafelhasználást, hogy értékeljük a bazális anyagcsere arányának különbségeit. Nem voltak szignifikáns különbségek a mozgásszervi aktivitásban, az oxigénfogyasztásban (VO 2), a légzőcsere arányban (RER), a szénhidrátfogyasztásban (CH) és a zsírfogyasztásban (FAT) a WT és az LMP7 -/egerek között - a normális táplálásban vagy a a HFD-etetés. (3B, C ábra). Ezt az eredményt alátámasztva, bár az Ucp1 (az 1-es fehérje vagy a termogenin leválasztása) expressziója megnőtt a barna zsírszövetben HFD-táplálással, a WT és az LMP7 -/- egerek között nem volt szignifikáns különbség az expressziójában (az adatokat nem mutatjuk be).

( NAK NEK ) Ételbevitel WT és LMP7 -/- egerekben normál táplálékban (n = 7–8) és HFD (n = 13–14). ( B ) Mozgásszervi aktivitás WT és LMP7 -/- egerekben normális táplálás és HFD esetén (n = 8 mindegyiknél). ( C ) Az energiafelhasználásra vonatkozó adatok. VO 2, RER, CH és FAT WT és LMP7 -/- egerekben normál étrendben és HFD (n = 8 mindegyiknél). Az adatokat átlag ± SEM-ben fejezzük ki.

Teljes méretű kép

Az LMP7 hiánya csökkenti a lipid felszívódást

Vita

A vizsgálat fő megállapításai a következők: (1) Az LMP7 hiány csökkentette a HFD által kiváltott zsírfelhalmozódást és védett az elhízás ellen; (2) Az LMP7-hiány javította a glükóz intoleranciát és az inzulinérzékenységet, valamint javította a lipid- és glükóz-anyagcserét (3) a WT és az LMP7 -/- egerek között nem volt különbség a táplálékbevitel, a mozgásszervi aktivitás és az energiafogyasztás között; (4) Az LMP7 hiány csökkentette a lipid felszívódást; (5) BMT kísérletek kimutatták, hogy a csontvelőből származó és nem csontvelőből származó sejtekben az LMP7 hozzájárult a HFD által kiváltott elhízás kialakulásához; (6) Az LMP hiánya csökkentette a gyulladásos reakciókat, például a makrofág infiltrációt és a kemokin expressziót, miközben növelte az adiponekciós termelést. Jelen tanulmány eredményei azt sugallják, hogy az LMP7 hozzájárul a makrofágok által vezérelt gyulladásos válaszokhoz a zsírszövetben, valamint az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásához. Tudomásunk szerint ez a tanulmány biztosítja az első bizonyítékot arra, hogy az LMP7 fontos szerepet játszik az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásában.

Egyre több bizonyíték jelzi, hogy a gyulladás fontos szerepet játszik az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulásában 1, 2. Noha számos jelentés ismerteti a gyulladás szerepét annak folyamatában, még nem teljesen tisztázott, hogy a gyulladás hogyan fordul elő és hogyan szabályozott. Bár ismert, hogy az immunproteazóma alapvető szerepet játszik az MHC I. osztályú antigének bemutatásában, a legújabb kutatások kimutatták, hogy az LMP7-re szükség van gyulladásgátló citokinek, például TNF-α és IL-6 előállításához, valamint a kísérleti ízületi gyulladás előrehaladásához. és vastagbélgyulladás 5, 6. Jelen tanulmányunkban bebizonyítottuk, hogy az LMP7 hiány gátolja a zsírszövet gyulladását, az elhízást és az anyagcserezavarokat: ez arra utal, hogy az LMP7 gátlásának lehetősége van elhízás és anyagcserezavarok megelőzésére és kezelésére. Valójában számos kísérleti tanulmány arról számolt be, hogy az ONX-0914 szelektív LMP7 inhibitor jelentősen hatékony a kísérleti ízületi gyulladás és vastagbélgyulladás 5, 6 kezelésében. Ezért ennek az LMP7 inhibitornak az elhízásra és az anyagcserezavarokra gyakorolt ​​hatását a jövőbeni vizsgálatok során még vizsgálni kell.

Megmutattuk, hogy az LMP7 hiány csökkentette a hasnyálmirigy lipáz expresszióját, megnövelte a széklet lipid tartalmát és gátolta a plazma TG szintjének növekedését orális olaj beadása vagy HFD táplálás után. Másrészt a szérum glükóz- és inzulinszintjét nem befolyásolta az LMP7 -/- egerek normál táplálékkal. A glükóz intolerancia és az inzulinérzékenység javult az LMP7 -/- egereknél. Ezért az LMP7 befolyásolja a hasnyálmirigy belső és külső szekréciós funkcióját, és részt vesz az emésztési és hormonális homeosztázisban, ami fontos lenne az egerek metabolikus állapotában.

Összefoglalva, világosan megmutatjuk, hogy az LMP7-hiány gátolja a makrofág-vezérelt gyulladást a zsírszövetben, és fokozza az elhízás és az anyagcserezavarok kialakulását a HFD-vel táplált egerekben. Megállapításaink alapján feltételezzük, hogy az LMP7 hiány gátolja a zsírszövet gyulladását azáltal, hogy gátolja a gyulladásgátló citokinek indukcióját a makrofágokban és az adipociták által termelt adiponekciót. Ezenkívül az LMP7 befolyásolja a hasnyálmirigy külső és belső szekréciós funkcióját. Jelen tanulmány nemcsak azt bizonyítja, hogy az LMP7 potenciális terápiás célpont lehet az elhízás és az anyagcserezavarok megelőzésében és kezelésében, hanem új betekintést nyújt e rendellenességek patofiziológiájának hátterében álló mechanizmusba is.

Mód

Állatok

Valamennyi állatkísérletet a Jichi Orvostudományi Egyetem laboratóriumi állatokra vonatkozó kísérleti állatgondozási és felhasználási bizottsága hagyta jóvá, és a Jichi Orvostudományi Egyetem irányelveinek megfelelően hajtották végre. A C57BL/6J WT egereket a Japan SLC, Inc.-től (Hamamatsu, Japán) szereztük be. Az LMP7 -/- egereket korábban leírták 4. A hím egereket (9-10 hetesek) 60 kcal% HFD-vel (kutatási étrend: D12492, Japan LSG, Tokió) vagy standard táplálékkal (CE-2; CLEA Japan Inc., Osaka) etették. Minden egeret 2 hetente lemértünk. A végpontokon az egereket 6 órán át éheztettük, újra lemértük, és vért gyűjtöttünk a szérum megszerzéséhez. A perfúzió után a szöveteket gondosan kivágtuk és lemértük.

Mikro-CT elemzés

A mikro-CT elemzést LaTheta LCT-200-mal (Hitachi Aloka Medical, Tokió, Japán) végeztük. Az izom, a zsigeri és a szubkután zsírtömeget LaTheta szoftverrel (Hitachi Aloka Medical) elemeztük.

Biokémiai teszt

Vért gyűjtöttünk 6 éhező egér farokvénájából. A vércukorszintet Terumo MEDISAFE ™ vércukormérővel (Terumo Co., Tokió, Japán) mértük. A TCHO és TG szérum vagy plazma szintjét FUJI DRI-CHEM rendszerrel (Fujifilm, Tokió, Japán) mértük. Az inzulin, az adiponektin és a leptin szérumszintjét ELISA kitek segítségével mértük (Sibayagi, Gunma, Japán; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN; és BioVendor R&D, Brno, Csehország).

GTT és ITT

A GTT-t egereken végeztük standard vagy HFD étkezésen 8 héten keresztül. Az egereket előzőleg 6 órán át éheztettük, szabadon hozzáférve a vízhez. A vércukorszintet ezután közvetlenül az intraperitoneális glükózinjekció előtt (1 g/testtömeg-kg fiziológiás sóoldatban), majd a beadás után 15, 30, 60, 90 és 120 perccel mértük. Az ITT-t hasonlóan végezték úgy, hogy glükóz helyett inzulint (0,75 E/testtömeg-kg) adtak be.

Szövettan és immunhisztokémia.

Az F4/80 és LMP7 HE festését és immunhisztokémiáját a 4., 23. korábban leírtak szerint hajtottuk végre .

Valós idejű RT-PCR elemzés

A teljes RNS-t a veséből készítettük az ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Japán) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően. Valós idejű RT-PCR elemzést a Takara TP960 PCR termikus ciklusos kocka detektáló rendszer (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) alkalmazásával végeztünk az mRNS expressziójának kimutatására a korábban leírtak szerint 23. A génexpressziót az Actb (β-aktin) expresszióval normalizáltuk, a rendszerhez mellékelt szoftverrel. Az RT-PCR elemzéshez használt primereket az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza.

BMT kísérletek

BMT egereket a korábban leírt módon állítottunk elő 24. A transzplantáció utáni csontvelő helyreállításának igazolására a protokoll alkalmazásával zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) rendelkező egereket használtunk donorként. Az áramlási citometriás elemzés azt mutatta, hogy a BMT után 8 héttel a perifériás vérsejtek több mint 90% GFP 24 pozitív sejtet tartalmaztak. Ezzel a protokollal 3 típusú BMT egeret generáltunk: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- egerek).

Légzési gázok és mozgásszervi elemzés

Az egereket egyenként egy metabolikus kamrában helyezték el 48 órán keresztül, hogy lehetővé tegyék számukra a környezethez való alkalmazkodást és az állandó légzéscsere-arány elérését (RER). A légzőgázok (O 2 és CO 2) elemzését nyílt áramkörű metabolikus gázanalízis rendszerrel végeztük, amely közvetlenül egy tömegspektrométerhez volt csatlakoztatva (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Japán). Az oxigénfogyasztást (VO 2) és a szén-dioxid termelést (VCO 2) minden ketrecben (egy egér) 5 percenként mértük. A RER-t a VCO 2/VO 2 arányként számoltuk. A teljes szénhidrátbevitelt (CH) és a zsírbevitelt (FAT) a Frayn sztöchiometriai egyenleteivel a következőképpen számoltuk: CH = 4,51 × VCO 2 - 3,18 × VO 2 [mg/perc], és FAT = 1,67 × (VO 2 - VCO 2) [mg/perc]. A mozgásszervi aktivitást minden fényképezőgépnél (egy egér) 5 percenként határozták meg az X és Y irányban megtört infravörös sugarak száma alapján, aktivitásfigyelő rendszer (ACTIMO-100; Shinfactory, Fukuoka, Japán) és metabolikus kamrák kombinációjával.

Széklet gyűjtése és lipid széklet kivonása

A HFD-vel táplált egér ürüléket, amelyet 24 órán át külön-külön tartunk, összegyűjtjük és vákuum centrifugálással szárítjuk. A szárított ürüléket lemérjük és mozsárban őröljük. Az őrölt ürüléket üvegcsőbe vitték, és lemérték. A lipideket kloroform: metanol (2: 1) eleggyel kétszer extraháltuk Folch módszerével, és lemértük. A lipidtartalmat az őrölt széklet tömegének% -ában számítottuk.

Áramlási citometriás elemzés

Az epididymális WAT-ban beszűrődő leukocitákat áramlási citometriával elemeztük a korábban leírtak szerint 11. Az áramlási citometriára vonatkozó adatokat a FACSVerse (BD Biosciences, San Jose, CA) alkalmazásával kaptuk, és a FlowJo szoftverrel (Treestar, Inc., San Carlos, CA) elemeztük. Az áramlási citometriás elemzéshez használt reagenseket az S2 kiegészítő táblázat sorolja fel.

In vitro kísérletek

Az egér peritoneális makrofágjait RPMI1640-ben (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) tenyésztettük, 10% magzati szarvasmarha-szérummal (FBS) és 1% antibiotikum-antimikotikummal (Invitrogen, Carlsbad, CA) kiegészítve 24-lyukú lemezeken. 48 óra elteltével a sejteket 24 órán át 400 μM palmitáttal (10% BSA) 26 stimuláltuk. A felülúszók IL-1β, IL-6 és TNF-α szintjét ELISA kitek (R&D Systems Inc.) segítségével határoztuk meg.

statisztikai elemzés

A normál eloszlású eredményeket paraméteres párosítatlan t-teszttel elemeztük. A normális eloszlás nélküli eredményeket Mann - Whitney teszttel, Kruskal - Wallis teszttel vagy longitudinális analízissel elemeztük. Az összes elemzést a Stata szoftver 13-as kiadásával (Stata Corp., College Station, TX) végeztük. A p értéke: