Eljárások hordozó lipidek előállítására banki élelmiszer-összetevők felszabadító rendszereként

  • Szerzői:Daniel Tenllado van Der Reijden
  • Szakdolgozati rendezők:Carlos Torres Olivares (rend. Tes.), Guillermo Reglero Rada (codirer. Tes.)
  • Olvasás: A Madridi Autonóm Egyetemen (Spanyolország) 2013-ban
  • Idióma: spanyol
  • Szakdolgozat minősítő bíróság:Tiziana Fornari (elnök), Luis Vázquez de Frutos (titkos), Ana Ramírez de Molina (szóvivő), E. Ibáñez Ezequiel (szóvivő), Rosa María Blanco Martín (szóvivő)
  • A teljes szöveg nem érhető el (További információ.)
  • Összegzés

    A strukturált lipid szintézisének vagy egy biológiai szempontból fontos anyag lipid transzportjának különféle elvégzendő technológiákra kell támaszkodnia. Ezeknek a technológiáknak iparilag méretezhetőnek, olcsónak és tisztának kell lenniük, mind a környezet szempontjából, mind a végtermék szennyeződések nélküli előállításához.

    lipidek

    A szintézis folyamata során mindenkor ismerni kell a minták összetételét, amelyekkel együtt dolgoznak, amelyeknél az a csoport, amelyben a doktorandusz dolgozott, elemzési módszereket publikált [1], és amelyekkel rendszeresen dolgoznak.

    Új elemzési eszköz és a minták mennyiségi meghatározásának robusztusabbá tétele érdekében új gázkromatográfiai módszer kidolgozására került sor. A cél az volt, hogy a kromatográfban levő mintát felosztjuk lipidosztályok szerint, és számszerűsíteni lehessen azokat anélkül, hogy a minta előzetes előkészítését el kellett végezni, amelyhez közvetlen injektálást végeztek az oszlopba. Az injektált minták mennyiségi meghatározásához dodekánt és hexadekánt használtunk belső standardként. Válaszfaktort kaptunk mindegyik vizsgált analitishoz tiszta koncentráció öt egymást követő injekciójával ismert koncentrációban [2]. A különböző csúcsok felbontása minden esetben nagyobb volt, mint 3,5, ami az összes vizsgált komponens teljes elválasztását jelzi.

    Az enzimatikus biokatalízis hatékony, szelektív és tiszta eszköznek bizonyult, mind a lipid szintéziséhez, mind katalizálásához. Az enzimek használata bizonyos ipari szakaszokban magas költségekkel jár a folyamatban, ezért elengedhetetlen a biokatalizátor újrafelhasználása. Viszont az enzim újrafelhasználását úgy kell elvégezni, hogy a kapott termék mindig azonos legyen, függetlenül az azonos tételű biokatalizátor újrafelhasználási ciklusától. Ehhez meg kell modellezni az enzimatikus reakció kinetikáját, az egyik legfontosabb paraméternek tekintve az enzim dezaktiválását.

    Különböző enzimek felhasználásával végzett különféle tesztek során számos reakciókörülmény mellett úgy döntöttek, hogy az alkoholizációs reakciókban a Pseudomona cepacia (nemrég Burkhoderia cepacia osztályba sorolt) lipázával dolgozunk együtt, mivel ez magas triglicerid konverziót (90%) eredményezett csökkentett idő alatt és újrafelhasználása megvalósítható volt, mivel dezaktiválása az alkoholizációs reakciókban nagyon alacsony volt. Ennek a lipáznak a kezeléséhez immobilizációs módszert fejlesztettek ki, amely lehetővé tette az enzim kinyerését minden reakcióciklus után.

    Látható volt, hogy a reakcióelegyben jelen lévő FAEE koncentrációk hogyan változtak a 2., 5., 10. és 15. ciklus alatt. A FAEE koncentrációja a reakció 6 órájában a 2., 5., 10. és 15. ciklusban 1104,3, 897,7, 613,9 és 441,8 mM volt. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a lipáz inaktiválása jelentős hatással volt a FAEE termelésére. Ha a deaktiválás elhanyagolható lenne, hasonló FAEE-szintet értek volna el a négy vizsgált ciklusban. Az enzimaktivitás időbeli csökkenésének leírására dezaktivációs kifejezést illesztettek be a kinetikai modellbe. Az illeszkedés minőségének javítása érdekében matematikai kifejezést alkalmaztunk az enzimatikus dezaktiváció leírására, amely irreverzibilis deaktiválási mechanizmusnak tekinthető, és ezzel párhuzamosan a lipáz irreverzibilis átrendeződése kíséri stabil aktív formát. Az enzim dezaktivációs modellel kapott értékek jól illeszkedtek a kísérleti adatokkal kapott értékekhez.

    Ez az eredmény azt mutatta, hogy a lipáz inaktiválásának legvalószínűbb mechanizmusa két párhuzamos folyamatot követett, amely a lipáz stabil és aktív formájához, valamint inaktív formához vezetett. Emiatt ezt a deaktiválási modellt alkalmazták a reakcióidő előrejelzésében a biokatalizátor optimális újrafelhasználása érdekében. Az enzimatikus dezaktiválás ezen terminusának beépítése lehetővé tette az álreakciós idő fogalmának használatát, amely az egyes ciklusok reakcióidejét megfelelő új értékekké alakítja át, vagyis olyanokká, amelyek akkor lettek volna elérhetők, ha az enzimet részben nem deaktiválják .

    Az álreakció idő fogalma reagál a lipáz inaktiválódására, és lehetővé teszi a különböző reakciók kinetikai adatainak kiigazítását ugyanazon lipáz adagban, de különböző mértékű dezaktiválással. Ennek a koncepciónak egy fontos alkalmazása az volt, hogy meg lehessen jósolni, hogy a reakcióelegynek mennyi ideig kell érintkeznie a lipázzal, hogy bizonyos mértékű alkoholízist érjen el, az alkalmazott lipáz dezaktiváltságának mértékétől függően.

    Az első jóslást ugyanazzal a mennyiségű lipázzal készítettük, amelyet az előző 15 tesztben használtunk. Ez a tétel egy immobilizált lipáznak felelt meg, amely 90 órán át működött alkoholizációs reakciókban. A cél továbbra is a TAG-ek 90% -os konverziójának elérése volt, ami 933,7 mM FAEE-koncentrációt eredményezett, amelyet célként tűzött ki. Ezt a koncentrációt úgy kellett elérni, hogy nem vettük figyelembe az alkalmazott lipáz maradék aktivitását. A javasolt deaktiválási modell szerint a FAEE ezen koncentrációja által kiváltott pszeudo-reakcióidő t * = 2772 óra volt. Végül a kinetikai modellel kapott egyenlet felhasználásával meg lehetett jósolni azt az időt, amely szükséges ahhoz, hogy a 16. ciklus tartson a FAEE megcélzott moláris koncentrációjának eléréséhez. Ez a reakcióidő 19,7 óra volt. A 16. alkoholizálási ciklust kísérleti úton, 19,7 órán át hajtottuk végre, így a FAEE koncentrációja 876,0 mM volt. Ez az eredmény ésszerű összhangot mutatott ki a kísérleti átalakítás és a kinetikai modell által megjósolt között.

    Egy biológiai és ipari szempontból fontos anyag lipidhordozásának példájaként elvégeztük a tirozol olajsavsavval történő észterezésének vizsgálatát. Ez a tanulmány a folyamatba beavatkozó különböző változók hatásának megismerésére összpontosított. A reakciót ekvimoláris körülmények között és oldószermentes reakcióközegben hajtjuk végre. A tirozol részecskeméretének, hőmérsékletének, biokatalizátor-koncentrációjának és csökkentett nyomásának hatásait tanulmányoztuk. Ezenkívül biokatalizátor újrafelhasználási vizsgálatokat, valamint antioxidáns aktivitást végeztek a rancimat teszt segítségével. Ezeket a vizsgálatokat az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumokban immobilizált Candida antarctica lipáz és a Novozym által immobilizált Candida antarctica lipáz összehasonlításával végeztük (435).

    Meg kell jegyezni, hogy a tirozol a vizsgált reakciókörülmények között nem oldódik olajsavban, és hogy a reakciósebesség lehetséges korlátozása a tirozol oldódási sebessége a reakcióközegben. Korábban leírták, hogy minél kisebb a reagensek részecskemérete, annál gyorsabb a reakció sebessége [4]. A tirozol oldódási sebességével járó tömegátadási korlátokat a reakcióelegyben kereskedelmi tirozol és 0,1 mm-nél kisebb szemcseméretű szitált tirozol alkalmazásával tanulmányoztuk. Nagyobb reakciósebességet 0,1 mm-nél kisebb szemcseméretű tirozol alkalmazásával értünk el. Meg kell jegyezni, hogy a rövid reakcióidő alatt (60 és 90 perc), szitált tirozolt használva, a reakció sebessége körülbelül 3 és 2-szer gyorsabb volt, mint az eredeti tirozollal. Ugyanakkor hasonló végleges konverziót értek el a két vizsgált esetben. A következő kísérletek során szitált tirozolt alkalmaztak reakció szubsztrátként.

    A tirozol oldhatóságát a reakcióelegyben értékeltük, és két különböző vizsgálatot hajtottunk végre. Először a tirozol olajsavban való oldhatóságát hasonlítottuk össze 40, 50 és 60 ° C-on. Meghatároztuk a tirozol oldhatóságát tirozol-oleátban 50 ° C-on. A kapott eredmények azt jelzik, hogy a tirozol olajsavban nagyon alacsony mértékben oldódik, azonban a tirozol tirozol-oleátban való oldhatósága négyszer nagyobb. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy az észterezési reakcióban keletkező tirozol-oleát javította a tirozol oldhatóságát a reakcióelegyben, így pozitívan járulhat hozzá az észterezési reakció sebességéhez.

    A tirozol olajsavval történő enzimatikus észterezését három különböző hőmérsékleten (40, 50 és 60 ° C) vizsgáltuk mindkét enzimmel. Ahogy az várható volt, minél magasabb a hőmérséklet, annál nagyobb észterezési sebesség figyelhető meg. A reakcióegyensúly akkor érte el, amikor a tirozol-oleát 40% -nál 73, m/m 50% -nál és 79% m/m-nél 60 ° C-on elérte a 73% w/w koncentrációt. Az összes vizsgált esetben az észterezés mértéke gyorsabb volt a Novozym 435 jelenlétében, mint a Candida antarctica lipáz oktil-szilícium-dioxid agglomerátumainak jelenlétében. Az agglomerátumokban az immobilizált lipáz alacsonyabb aktivitása, mint a kereskedelmi forgalomban, valószínűleg a Candida antarctica lipáz alacsonyabb terhelésének volt köszönhető az agglomerátumokban. A lipáz aktivitásának a lehető legnagyobb mértékű megőrzése és a tirozol illékonyodásának és lebomlásának minimalizálása érdekében a kísérleteket ezentúl 50 ° C-on hajtották végre.

    A reakciókeverékhez adagolt immobilizált lipáz százalékos arányának csökkentésével a legnagyobb előnye, hogy csökkenti a bioprocess költségét, valamint csökkenti a reakcióelegyben lévő szilárd anyag mennyiségét, ami különösen fontos, ha az anyag százalékos aránya A reakcióelegyben lévő szilárd anyag nagyon magas, meg kell jegyezni, hogy a reakció kezdetén a tirozol a reakcióelegy körülbelül 33% -át teszi ki. Az immobilizált lipáz két különböző százalékát hasonlítottuk össze a tirozol-oleát enzimatikus szintézisében, 5% és 10% w/w. A biokatalizátor mennyiségének csökkenése a két immobilizált lipázzal történő reakció sebességének jelentős csökkenését eredményezte, ezért a következő kísérletek során 10 tömeg% biokatalizátort használtunk fel.

    A légköri nyomáson végzett összes észterezési reakció egy tirozol-oleátból, valamint változó mennyiségű reagálatlan olajsavból és tirozolból álló termékkeverékhez vezetett. Annak érdekében, hogy a reakció egyensúlyát a tirozol-oleát képződése felé tolják el, az észterezési reakció során keletkezett vizet el kellett távolítani.

    E cél elérése érdekében különböző stratégiák alkalmazhatók, mint például a nitrogén átömlesztése, szárítószer használata vagy a reakció csökkentett nyomáson történő végrehajtása. A reakciót vákuumban (200 mbar) végezzük, és kevesebb mint 3 óra alatt több mint 85% tirozol-oleátból álló termékkeveréket kapunk mind a Novozym 435-tel, mind az oktil-agglomerátumokba immobilizált Candida antárctica lipázzal. . Nagyobb vákuumra volt azonban szükség a víz teljes eltávolításához a reakcióelegyből. Ezért az olajsav és a tirozol 85% -nál magasabb konverziójának eléréséhez 10 mbar vákuumot alkalmaztunk.

    Ilyen körülmények között több mint 95% tirozol-oleátot tartalmazó termékkeveréket kaptunk, 2 óra alatt a Novozym 435 esetében, és 3 óra alatt az agglomerátumokba immobilizált Candida antarctica lipázhoz. A két immobilizált enzim eltérő víztartalma (1,77% a Novozym 435 és 2,17% az oktil-szilícium-dioxid agglomerátum esetében) szintén fontos szerepet játszhat a megfigyelt reakciósebességben.

    Egy másik fontos szempont, amelyet figyelembe kellett venni, a tirozol részleges volatilitása volt. Más szerzők [5] megfigyelték, hogy a túlzott vákuum és hőmérséklet a tirozol részleges desztillációjához vezethet. A tirozol részleges párolgásának értékelése érdekében a fentiekhez hasonló, de enzim hozzáadása nélküli reakcióelegyet vákuumba (10 MB) helyeztünk 8 órán át. Ezután az elegy aliquot részét elemeztük, és a tirozoltartalmat összehasonlítottuk a kiindulási keverékével. A vizsgált mintákban azonos százalékos tirozolt figyeltek meg, ami azt jelzi, hogy a tesztelt kísérleti körülmények között a tirozol párolgása elhanyagolható.

    A víz eltávolítása a reakcióelegyből két ellentétes hatással járhat: 1) a reakció egyensúlyának elmozdulása a tirozol-oleát képződése felé és 2) az immobilizált lipáz dehidratálása, amely befolyásolja a biokatalizátorok maradék aktivitását. Mint korábban említettük, a lipáz újrafelhasználása kulcsfontosságú tényező az alkalmazott biokatalízisben. Ezért egyensúlyt kell elérni a reakciósebesség és az enzimstabilitás között.

    Az észterezési reakció után a lipáz maradék aktivitásának ellenőrzése céljából három egymást követő tesztet hajtottunk végre ugyanazzal a tétellel mindkét lipáz esetében.

    A tirozol-oleát enzimes szintézisének 2. és 3. vizsgálata (mindkettőt az első teszt reakcióelegyből kinyert impregnált lipázzal hajtották végre) hasonló reakciósebességet eredményezett, jelezve, hogy a két enzim immobilizátum inaktiválása elhanyagolhatónak tekinthető. Megfigyelhető az is, hogy a két vizsgált immobilizált alany esetében a 2. és a 3. vizsgálat lassabb volt, mint az első vizsgálat. Ez a reagensek megnövekedett diffúziós korlátainak tudható be, amikor a lipázt előzőleg a reakcióelegybe mártották.

    Ezekkel a reakciókörülmények között több mint 95% tirozol-oleátból álló termékkeveréket lehetett előállítani 2 óra alatt a Novozym 435-tel és 5 óra alatt az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumokkal. Bár mindkét katalizátor stabilitása hasonló volt, az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumokkal elért reakciósebesség alacsonyabb volt, mint a Novovozym 435 esetében. Az immobilizáltak oktil-szilícium-dioxid agglomerátumok segítségével történő optimalizálása, hogy aktívabb és/vagy nagyobb enzimterhelésű biokatalizátort kapjunk gramm támogatásra szükség van.

    A tirozol olajsavval történő észterezéséhez szükséges mindkét biokatalizátor összehasonlítása érdekében ezt a Novozym 435 és az oktil-agglomerátumok szilícium-dioxidban lévő immobilizált Candida antarctica lipázjának azonos aktivitási egységeivel (1 687 AU) hajtottuk végre. Az eredmények azt mutatták, hogy a reakció sebessége hasonló volt a két vizsgált lipázhoz. Ezért arra a következtetésre jutott, hogy a reakciósebesség különbségét nem az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumok miatti tömegátadás vagy diffúziós korlátok növekedése okozta, és ezért kijelenthető, hogy a reakció sebességében mutatkozó különbségek az előző kísérleteket kizárólag a több milligramm enzim/gramm hordozónak tulajdonították a Novozym 435-ben, összehasonlítva az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumokban immobilizált Candida antarctica lipázéval. Emiatt kényelmes új vizsgálatokat végezni az új hordozó terhelhetőségének javítása érdekében, így nagyobb mennyiségű enzimet lehet beépíteni egy gramm biokatalizátorba.

    Ezenkívül a tirozol-észterek előállításának eltérő eljárása a kapott vegyületek eltérő végső antioxidáns aktivitásához vezethet.

    Az előző kísérletek során megfigyelt reakciót kizárólag a Novozym 435-ben a magasabb gramm enzim/gramm hordozónak tulajdonítottuk, mint az oktil-szilícium-dioxid agglomerátumokban immobilizált Candida antarctica lipáz reakcióinak. Emiatt kényelmes új vizsgálatokat végezni az új hordozó terhelhetőségének javítása érdekében, így nagyobb mennyiségű enzimet lehet beépíteni egy gramm biokatalizátorba.

    Ezenkívül a tirozol-észterek előállításának eltérő eljárása a kapott vegyületek eltérő végső antioxidáns aktivitásához vezethet.