Cikkek

A SPERMA KRIIOBIOLÓGIA ALAPJAI SEMEN BANKOKHOZ

Ana Fernández 1, Maria del Carmen Gonzalvo 1 Ana Clavero 1, Rafael Ruiz de Assín 1, Sandra Zamora 1, María Roldán 1, Belén Rabelo 1, Juan Pablo Ramírez 2.3 Alberto Yoldi 2, José Antonio Castilla 1,2,3
1 Emberi reprodukciós egység, „Virgen de las Nieves” Egyetemi Kórház, Granada.
2 CEIFER Semen Bank, Granada.
3 Külső minőség-ellenőrzési program a Szaporodási Biológia Tanulmányozásáért Egyesület (ASEBIR) szaporodási laboratóriumához, Madrid.

bankokhoz

Megjelent a magazinban 2009. június 14.

Absztrakt: A spermiumoknak különleges jellemzői vannak a fagyasztásra, ebben a munkában ezeket a jellemzőket és a spermiumok túlélésre gyakorolt ​​hatását elemezzük a spermabankokban. Ezek között vannak a fagyasztandó sejttípusra jellemző tényezők és a fagyasztási protokolltól függő tényezők. Az előbbiek között beszélhetünk a sejtek méretéről és permeabilitásáról, az utóbbiak között pedig megtalálhatjuk a fagyásgörbét és a krioprotektorok hozzáadását.

A fagyásgörbe a fagyásra (hideg sokk, jegesedés és olvadás) adott sejtreakcióra utal, amely krioindukált elváltozásokat okozhat, például sejten belüli jégképződést, ozmotikus stresszt vagy újrakristályosodást. E károsodások elkerülése érdekében minden protokoll alapvető részként leírja a krioprotektív szerek függőségét, amelyek előnyösek a sejtek túlélése szempontjából, bár tartalmaznak olyan káros szempontokat is, mint például toxicitásuk. Végül elemezzük a sperma vitrifikációjának alapjait és szerepét a spermabankokban.

Kulcsszavak: spermabank, kriobiológia, vitrifikáció

A SPERMA BANKOKRA ALKALMAZOTT SPERMA KRIOBIOLÓGIA ALAPJAI

Összegzés: A spermiumoknak különleges fagyási jellemzői vannak, ezeket a jellemzőket és a spermium bankokra alkalmazott spermatikus túlélésre gyakorolt ​​hatásokat elemezzük ebben a munkában. Közülük különös fagyasztási tényezőket találunk a sejttípustól és a fagyási protokolltól függően. Ezek közül a mérettel és a sejtek permeabilitásával kezdjük, másodszor pedig megnézzük a fagyásgörbét és a krioprotektorok hozzáadását.

A fagyásgörbe a fagadásra adott reakcióra (hideg sokk, jégképződés és olvadás) utal, amely olyan krioinérüléseket válthat ki, mint például az intracelluláris jégképződés, az ozmotikus stressz vagy az újrakristályosodás. E károsodások elkerülése érdekében az összes protokoll alapvető intézkedésként leírja a krioprotektorok hozzáadását, amelyek a sejt túlélése szempontjából előnyösek, bár toxicitásuk miatt káros szempontokat is okoznak. Végül elemezzük a spermiumok vitrifikációjának alapjait és szerepét a spermabankokban.

Kulcsszavak: spermabank, kriobiológia, vitrifikáció

BEVEZETÉS

A spermium krioprezerválásának fő célja életképességének és funkcionalitásának fenntartása alacsony hőmérsékleten, hosszú ideig. A mélytartósított sejteket -196 ° C-on, folyékony nitrogénben tároljuk. Ezen a hőmérsékleten nincsenek sem diffúziós jelenségek, sem elegendő hőenergia a kémiai reakciók végrehajtásához. Ezért a fagyasztás nehézségei nem alacsony hőmérsékleten tartásból, hanem hűtési és fűtési folyamatokból fakadnak.

Ezen folyamatok során a sejtek vizes oldatban szuszpenzióban vannak. Az említett oldat olyan kolligatív tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek alapvetően a benne lévő molekulák számától és nem a természetüktől függenek. Így oldott anyag hozzáadása az oldathoz csökkenti a fagyáspontot (krioszkópos pont) és a gőznyomást, emeli az ozmotikus nyomást és a forráspontot. Az ozmózis a víz mozgása az oldott anyag alacsony koncentrációjú oldatából az oldott anyag magas koncentrációjú oldatába és az ozmotikus nyomáshoz vezet. Ezeket a tulajdonságokat szem előtt kell tartani, amikor a fagyasztási folyamat során a hőmérséklet csökken, az extracelluláris közegben jég kezd kialakulni, mivel a jég részét képező víz nem tartalmazza az oldott oldott anyagokat, növelve ezek koncentrációját az extracelluláris közegben (hiperoszmotikus) és ennek kolligatív tulajdonságainak módosítása.

E folyamatok során a sejtek ozmométerként viselkednek, térfogatukat változtatva reagálnak az extracelluláris ozmotikus változásokra, így a sejtek elveszítik vagy elkapják a vizet attól függően, hogy hiper- vagy hipo-ozmotikus extracelluláris közegnek vannak-e kitéve; a víz és a krioprotektorok mozgását a sejthártyán a krioprezerválás során különféle biofizikai paraméterek szabályozzák, amelyeket meg kell határozni az egyes sejttípusokhoz, különböző hőmérsékleteken, és végül felelősek lesznek a sejtek károsodásáért.

A SZÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS FOGALMAI FAGYASZTÁS ÉS JELEN LEOLGASZTÁS ALATT

Példaként a cellát "zacskónak" tekinthetjük, amely fagyasztó közegbe (extracelluláris közegbe) merített sóoldattal van megtöltve. A zsákburkolatnak, vagyis a sejtmembránnak féláteresztő membrán tulajdonságai lesznek.

A membrán viselkedését meghatározó két fő jellemző: méret és permeabilitás.

MÉRET

Ez a membránterület áll rendelkezésre a víz cseréjére a külső környezettel.

ÁTERESZTŐKÉPESSÉG.

Ez a paraméter határozza meg, hogy a víz mennyire könnyedén juthat át a membránon a koncentrációgradiens mellett. A sejtmembrán permeabilitását olyan törvény szabályozza, amely tükrözi azt az empirikus tényt, hogy minél alacsonyabb a rendszer hőmérséklete, annál alacsonyabb a membrán permeabilitása. Ily módon a sejtmembrán elveszíti féligáteresztő jellegét, hogy átjárhatatlanná váljon, egy bizonyos kritikus hőmérséklet alatt. Amikor a rendszert e kritikus hőmérséklet alá hűtjük, a dehidratációs folyamat leáll, ez az intracelluláris jégképződés valószínűségének növekedését jelenti. A laboratóriumi kísérletek azt mutatják, hogy a sejtmembrán áteresztőképessége a rendszer hőmérsékletének függvényében változik az extracelluláris közegben lévő oldott anyag koncentrációjától is.

A "zsák" tartalmát, vagyis az intracelluláris táptalajt két régió alkotja:

OSMOTIKUSAN TÉNYLEGES KÖTET

Ebben a régióban a sejt belső organellumait, a sejtmagot, makromolekulákat, például fehérjéket stb. A sejt belső részei, amelyek nem avatkoznak be a vízi szállítási folyamatba. Meghatározzák azt a vizet, amely soha nem hagyja el a sejt belsejét az extracelluláris térben az oldott anyagok koncentrációjának növekedésére reagálva, mivel makromolekulákkal és intracelluláris szerkezetekkel társul. Ha egy sejt dehidratálódik, és méretét meghaladja az ozmotikusan inaktív térfogaton, életképessége veszélybe kerülhet (Meryman minimális térfogat-hipotézise a fagyás alatti sejtsérülés magyarázatára) (Meryman, 1970).

OSMOTIKUSAN AKTÍV KÖTET

Ebbe a régióba beletartozunk az intracelluláris oldat, amelyben a belső organellák, a mag stb. Lebegnek, és elhagyhatják a sejtet.

Celluláris válasz a fagyásra

HIDEG ÜTÉS ÉS HŰTÉSI KÁROK (37–0 ° C-TÓL)

A hideg sokk sejtkárosodás a hűtési sebességre való érzékenység miatt, és a lipid fázisban bekövetkező átmeneti hatások okozzák (Drobnis et al., 1993). A hűtési sérülés egy adott hőmérsékletre vagy hőmérséklet-tartományra való érzékenység miatt bekövetkező kár.

A zsírsavak rendezett merev állapotban (gél) vagy rugalmasabb és viszonylag rendezetlen állapotban (folyadék) létezhetnek. Az egyik állapotból a másikba történő átmenet egy hőmérséklet-tartományban történik, amelynek átlagát fázisátmeneti hőmérsékletnek ("olvadási hőmérséklet", Tm) nevezik. Ez az átmeneti hőmérséklet magasabb vagy alacsonyabb lesz, a membrán zsírsavainak összetételétől függően. A legtöbb eukarióta sejtmembrán Tm értéke 0 ° C és 20 ° C között van.

A plazmamembránban a fázisátalakulás nem fordul elő egyszerre minden foszfolipidjében, ezért az átmenet során a folyadék állapotban lévő domének és a gél állapotú domének együttélése várható. Ez a helyzet hibákat okoz a membránok csomagolásában, és az oldott anyagok nagyobb permeabilitásával jár együtt rajta keresztül. Így bebizonyosodott, hogy az adott kétrétegű átmeneti hőmérséklet elérésekor az oldott anyag legnagyobb vesztesége a membránon keresztül történik.

Ezen túlmenően ez a változás fizikai változásokat okoz a plazmamembránban a lipid-csomagolási hibák indukálása miatt; a lipid-fázis átmeneti változásai nem-lineáris kinetikus válaszokat okoznak egyes enzimekben, köztük néhány membrán ATPázban. Valószínű, hogy ezek a hatások részben felelősek a sejt kalciumkoncentrációjának rossz szabályozásáért, ami 17 ºC alatti hőmérsékleten nyilvánvaló (Bailey et al., 1994).

A hősokk enyhíthető krioprotektív szerekkel, bizonyos foszfolipidek (foszfatidil-szerin) jelenlétével, lassú fagyasztással és előkondicionálással magas sótartalmú közegben. Úgy tűnik, hogy az emberi spermát kevéssé érinti a hideg sokk és a hidegrázás, valószínűleg membránjának összetételének köszönhetően (Holt, 2000).

JÉGKÉPZÉS (0 ° C és 2500 ° C/perc között, amelyek intracelluláris jégkristályokat képezhetnek, és károsíthatják a spermiumokat. A fagyás sebességének növelése érdekében a klasszikus szalmán kívül más eszközöket is alkalmaztak, amelyek lehetővé teszik a sejtek szuszpenziója és a folyékony nitrogén közötti nagyobb érintkezést mint például az elektronmikroszkópos rácsok, félig szívószálak, krioloop, kriotóp, kriotip és kriolevelek (Fuller és mtsai, 2004). A hűtési és fűtési sebesség akár 30 000 ° C/perc, illetve 42 000 ° C/perc értékre is növekedhet, és így sikeresen Ennek a nagy sebességnek az eléréséhez szükséges, hogy a spermiumok térfogata nagyon kicsi legyen (mikron), ami nagyon alacsonyvá teszi az üvegesített spermiumok számát, ez a technika nem hasznos mesterséges megtermékenyítésre szánt spermafagyás esetén. vagy IVF, csak az ICSI esetében.

Látták azonban, hogy a spermiumok képesek regenerálódni vitrifikációs technikákkal CPA hozzáadása nélkül, nagyon magas hűtési sebességek alkalmazásával, amelyek bizonyos mértékben függhetnek a membrán magas vízáteresztő képességétől (Isachenko et al., 2004 ) vagy szacharózt használnak egyetlen krioprotektorként (Hossain et al., 2007) vagy glicerint (Schuster et al., 2003). Ezért a spermium vitrifikációs technikáinak szerepét még tisztázni kell.

Hivatkozások

Merryman HT. A minimális tolerálható sejttérfogat túllépése hipertóniás szuszpenzióban a fagyos sérülés okaként. In: O'Connor GEW (szerk.) The Frozen Cell. CIBA Alapítvány Szimpózium. Churchill Press, London, 1970; 565-9.

Drobnis EZ, Crowe LM, Berger T és mtsai. A hideg sokk károsodása a sejthártyák lipid fázisátmenetei miatt következik be - ez a demonstráció spermiumot használ modellként. J Exp Zool 1993; 265: 432–7.
Bailey JL, Robertson L, Buhr MM. Az in vivo termékenység, a számítógéppel elemzett mozgékonyság és az in vitro Ca2 + fluxus közötti összefüggések a szarvasmarha-spermiumokban. Can J Anim Sci 1994; 74: 53–8.

Mazur P. Az intracelluláris fagyás szerepe a szupraoptimális sebességgel lehűlt sejtek halálában. Kribiológia 1977; 14, 251-72.

Fuller B, Paynter S. A kriobiológia alapjai a reproduktív orvoslásban. RBM a 2004-es vonalon; 9: 680-91.

Mazur P. A sejtek vízveszteségének kinetikája szubzérus hőmérsékleten és az intracelluláris fagyás valószínűsége. J Gen Physiol 1963; 47: 347-69.
Rall W, Reid D, Farrant J. Ártatlan biológiai fagyasztás a felmelegedés során. Természet (London) 1980; 286: 511-4.

Holt WV. A sperma fagyasztott tárolásának alapvető szempontjai. Anim Reprod Sci, 2000; 62: 3-22.

Nei T. A fagyasztott sejtek szerkezete és működése: fagyásminták és olvadás utáni túlélés. J Microsc 1978; 112 (2): 197-204.

Mazur P. Az élő sejtek fagyása: mechanizmusok és következmények. Am J Physiol 1984; 247, C125 - C142.

Leibo SP, Farrant J, Mazur P és mtsai. A fagyás hatása a velő őssejt-szuszpenziókra: hűtési és felmelegedési sebesség kölcsönhatásai PVP, szacharóz vagy glicerin jelenlétében.
Kriobiológia 1970; 6: 315–32.

Nei T. Az eritrociták hemolízisének mechanizmusa fagyasztással, különös tekintettel a nulla közeli hőmérsékleten történő fagyasztásra. In: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., A fagyott sejt. Churchill, London, 1970; 131–47.

Mazur P, Leibo SP, Farrant J és mtsai. A hűtési sebesség, a felmelegedési sebesség és a védő adalék kölcsönhatásai a fagyasztott emlős sejtek túlélésén. In: Wolstenholme, G.E.W., O'Connor, M. Eds., The Frozen Cell, London: Churchill; 1970 69–88.

Lovelock JE. Az emberi vörösvértestek hemolízise fagyasztással és felolvasztással. Biochim Biophys Acta 1953; 10 (3): 414-26.

Karow AM Jr., Webb WR. A szövet fagyasztása. A sérülés és a túlélés elmélete. Kriobiológia 1965; 2 (3): 99-108.

Nijs M, Ombelet W. Humán spermiumok krioprezerválása. Hum Fertil 2001; 4: 158-63.

Gao D, Liu J, Liu C és mtsai. Az emberi spermiumok ozmotikus károsodásának megelőzése a glicerin hozzáadása és eltávolítása során. Hum Reprod 1995; 10: 1109-22.

Gilmore JA, Liu J, Gao DY és mtsai. Az optimális krioprotektánsok meghatározása és az emberi spermiumokból történő hozzáadásuk és eltávolításuk módszerei Hum Reprod 1997; 12: 112–8.

Lovelock JE, Polge C. A spermiumok immobilizálása fagyasztással és felolvasztással, valamint a glicerin védő hatása. Biochem J 1954; 58: 618–22.

Hammerstedt RH, Graham JK. Baromfi spermájának krioprezerválása: a glicerin rejtélye. Kribiológia 1992; 29: 26–38.

Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Az emlős spermájának krioprezerválása: mit kérünk tőlük a túléléshez. J Androl 1990; 11: 73–88.

Gilmore JA, McGann LE, Liu J, Gao et al. A krioprotektív oldott anyagok hatása az emberi spermiumok vízáteresztő képességére. Biol Reprod 1995; 53: 985–995.

Taylor MJ, Song Y, Brockbank KG. Vitrifikáció a szövetek megőrzésében: új fejlemények. In: Fuller BJ, Lane N, Benson EE (szerk.) Élet a fagyott állapotban. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 2004; 603–42.

Hossaim AM, Osuamkpe CO. A szacharóz egyedüli felhasználása az emberi sperma krioprezerválásában. Arc Androl 2007; 53: 99-103.

Schuster TG, Keller LM, Dunn RL és mtsai. Nagyon alacsony számú spermium ultragyors fagyasztása krioloop segítségével. Hum Reprod 2003; 18: 788-95.