• Tárgyak
  • Összegzés
  • Bevezetés
  • Eredmények
  • Vita
  • Mód
  • minta előkészítése
  • A labor beállítása
  • Adatfeldolgozás (labor beállítás)
  • ID19 konfiguráció (ESRF)
  • Adatfeldolgozás (ID19)
  • Kiegészítő információk
  • PDF fájlok
  • Kiegészítő információk
  • Videók
  • 1. kiegészítő videó
  • 2. kiegészítő videó
  • Hozzászólások

Tárgyak

Összegzés

Bevezetés

Itt bemutatjuk a terjedés-alapú fáziskontraszt-tomográfiát egy folyékony fémsugár 20 laboratóriumi forrás, műszerezés, minta-előkészítés és rekonstrukciós algoritmus optimalizált kombinációjában, nagy mennyiségű egér agyszövet képalkotására. Megmutathatjuk, hogy a rekonstruált térfogaton belül nagy kontraszt érhető el jelölés nélkül, és hogy egy érdekes régióban (ROI) az egyes neuronok vizualizálhatók. Ez hozzáférést biztosít az agy érintetlen 3D cytoarchitektúrájához.

cytoarchitektúrája

Új mintakészítési technikánkban a szövetet etanolban végzett dehidratálás után xilolba helyezzük, hasonlóan a paraffinba ágyazás szokásos protokolljához. Döntő és új lépésként mellőzünk minden további inklúziós vagy kontrasztos eljárást, és a szerves oldószer elpárologtatása után megmérjük a mintát. A magas Z-tartalmú elemekkel való festéstől eltérően ez a technika, amelyet EOS-készítménynek (szerves oldószer elpárologtatása) nevezünk, lényegesen csökkenti a felszívódást a víz és a lipidek eltávolítása miatt, miközben új kontrasztot generál a fehérjemátrix között.

A rekonstrukció a tomográfiai felvétel minden egyes szögéhez rögzített vetületi képek fázis-helyreállításával kezdődik. Azoknál a tárgyaknál, amelyek abszorpciója lassan változik, az objektum mögött kis z terjedési távolságban, az intenzitás eloszlása ​​a 21 intenzitás transzportegyenlet hozzávetőleges alakjával fejezhető ki

ahol I 0, θ ( r ⊥) és ϕ θ ( r ⊥) jelölje az intenzitást és a fáziseloszlást közvetlenül a tárgy mögött, és

ahol az α γ-függő szabályozási paraméterrel helyettesítették. Megállapítottuk, hogy ez a rekonstrukciós megközelítés, amelyet Witte et al. és Bronnikov-asszisztált korrekció (BAC) 22 néven ismert, kiváló eredményeket kínál a jelenlegi foltos szövetek és az alkalmazott mikrofókuszos CT-konfiguráció esetében 23. Ezért a jelen munkában alapértelmezett algoritmusként használják (1d., E. Ábra). A fázis-helyreállítási algoritmusnak a tomográfiai vizsgálat minden vetületén történő alkalmazása után a 3D rekonstrukciót szűrt hátsó vetítéssel (kúpnyaláb) hajtják végre 24. Ne feledje, hogy a rekonstruált objektum kontrasztját effektív mennyiségnek kell tekinteni, egyrészt mivel mind az abszorpció, mind a fázis kölcsönhatás hozzájárul az értékéhez, másrészt mivel áramlási okokból a laboratóriumi CT általában szélessávú sugárzást alkalmaz, szemben a szinkrotron CT-vel.

Teljes méretű kép

Bemutatjuk a laboratóriumi beállítások képességeit a vad típusú egér agy különböző érdekes régióinak képalkotásával.

Eredmények

Kúpnyaláb és fordított geometria képalkotási módok kombinációja (nak nek) Az egér jobb agyféltekéjének térfogati ábrázolása kúpnyaláb-geometriában rögzítve. A szürke síkok jelzik a ( b, c ). (időszámításunk előtt) Koronális/vízszintes metszet a rekonstruált köteten. d) Rekonstruált koronaszelvény a hippokampusz régióból sejtfelbontás mellett, fordított geometriában rögzítve. A nagy felbontású mérés helyzetét a minta teljes térfogatához viszonyítva a ( b ). A tomográfiai rekonstrukció előtt az egyedi nézeteket 2-szeres faktorral vettük át. (és) 31 egymást követő szelet maximális intenzitású vetítése, 30 μm vastag szövettani metszetet utánozva. (F) A kérgi régió rekonstruált vízszintes szakasza. g) 31 vágás maximális intenzitású vetülete. Jól láthatóak a kiemelkedő kérgi tulajdonságok, mint például a hordómező. Méretarányok: ( b, c 500 μm, ( d - g ) 200 μm.

Teljes méretű kép

Az egér kisagyi vermis sejtszintjéig csökkenő térfogat (nak nek) Keresztmetszet a rekonstruált térfogaton, bemutatva a kisagyi vermis molekularétegét (ML), szemcsés rétegét (GL), fehérállományát (WM) és Purkinje sejtrétegét (PCL) a sejtfelbontásban. A tomográfiai rekonstrukció előtt az egyedi nézeteket 2-szeres faktorral vettük át. b) A kötet hosszmetszete elegendő kontrasztot mutat az axonkötegek fehérállományon belüli azonosításához. c) A minta térfogatának automatikus ábrázolása a térfogaton belüli szelettel, jelezve a cella szegmentálás helyét ( d ). d) A minta kis részének sejtszegmentálása. Mérlegsorok: 200 μm.

Teljes méretű kép

Összehasonlításképpen és összehasonlításképpen egy hasonló minta mérését is elvégeztük az ID19 gerenda vonalon az ESRF-en Grenoble-ban (S4. Kiegészítő ábra, S1. Táblázat és 2. videó). A rekonstruált térfogatok összehasonlítása azt sugallja, hogy a laboratóriumi beállítás alacsonyabb fényereje, valamint a hosszú expozíciós idő ellenére összehasonlítható minőségűek és felbontásúak, mindkettő mm-es térfogatban mutatja a sejtek részleteit.

Vita

A virtuális 3D szövettan ezen új formája elkerüli a klasszikus szövettan hátrányait, például az időigényes és invazív minta-előkészítést vagy a vágási eljárás miatti mechanikai torzulásokat, és virtuális szövettani metszeteket biztosít bármilyen kívánt irányban és vastagságban. Ami a legfontosabb, hogy a szerkezetelemzés 2D helyett 3D-ben is elvégezhető, amely lehetővé teszi az idegi kapcsolódási problémák kezelését és a kvantitatív geometriai elemzést.

A soros metszetek klasszikus szövettani festése továbbra is az agy szerkezetének elemzésének alapját képezi számos olyan tanulmányban, amely mutáns egerek fenotipizálásával vagy kísérletileg kiváltott kóros változásokkal jár az agyi betegségek rágcsálómodelljeiben. A 3D optikai technikákkal összehasonlítva megközelítésünk előnyöket kínál a nagy áteresztőképességű vizsgálatok szempontjából, mivel nem igényli a sejtek festését vagy jelölését, ami időigényes lépés a minta előkészítésében. Ezenkívül a jelenlegi protokollunkban szereplő viszonylag hosszú pásztázási idők korlátozó tényezője valószínűleg a jövőben túllépni fog, mivel jó jel/zaj arány már elérhető rövidebb expozíciós időkkel (lásd az S5. a folyadéksugaras anód technológia várhatóan jelentősen megnöveli a forrás fényerejét. Ezenkívül, ha rendelkezésre áll a sugáridő, a szinkrotronon kísérleteket lehet végezni, lehetővé téve a minták gyors képét, kissé nagyobb kontrasztú és felbontású.

Ne feledje, hogy a nagy felbontás és a kontraszt elérésének módja mind a szövetek előkészítése, mind az alapfizika tekintetében azt sugallja, hogy protokollok dolgozhatók ki a cyto és a rost 3D-s architektúrájának tanulmányozására az emberi agyban. A készítmény alacsony felszívódása nagyban megkönnyíti a nagy minták mérését.

A nagy felbontás és a laboratóriumi forrásokkal való kontraszt elérésének lehetősége alkalmassá teszi módszerünket a biomedicinális vizsgálatok széles körére, amelyek nagyobb hozzáférhetőséget és teljesítményt igényelnek.

Mód

minta előkészítése

A protokoll kidolgozása során a CT-kísérletekhez nem használt agyakat néha több hétig etanolban tárolták. Nem észleltünk semmilyen változást a szárítási viselkedésben vagy a makroszkopikus morfológiában. Ezen agyak egy részét rehidrálták (S6. Kiegészítő ábra). A rehidratálási idő függ a különböző oldatok és száraz állapotú tárolási időktől. Ezt nem szisztematikusan tesztelték.

Nem észleltek változást a bruttó vagy a kontrasztos megjelenésben, amikor az egész agyat megszárították az agy kisebb részeihez képest. A CT-objektumtartókra történő felszerelésre alkalmas kis mintaméretek elkészítése könnyebb volt, amikor a mintákat szárítás előtt készítették el. Megjegyezzük azt is, hogy a teljes eljárás nagy mintákra alkalmazható (pl. Egész egér test, mint a legnagyobb tesztelt minta). A xilol párolgása a szövet összehúzódását okozta, de nem változtatta meg az általános morfológiát (S6. Kiegészítő ábra).

A labor beállítása

A laboratóriumi általános beállítás vázlata az 1. ábrán látható. A folyékony fém sugárforrás (Excillum, Stockholm, Svédország) Galinstanból (68,5% Ga, 21,5% In és 10% Sn) áll, a jellemző fotonenergia 9,25 keV (Ga-K α). A kísérletekhez 40 kV-os csőfeszültségen működtettük, és az elektronokat 10 × 40 µm 2 méretre fókuszáltuk, ennek eredményeként hozzávetőlegesen 10 × 10 µm 2 fókuszpont-méretet kaptunk. A mintát három transzlációs tengellyel és egy forgótengellyel rendelkező mintatoronyba helyezzük a tomográfiai mérésekhez. Ezenkívül a gerendára párhuzamosan és merőlegesen két transzláció lehetővé teszi a forgástengely pozícionálását az optikai tengelyhez képest. A dőlésszög és a forgástengely nulla helyzetének összehangolása érdekében az érzékelőt egy emelvényre helyezzük, az optikai tengelyre merőlegesen két átfordítással.

Fordított geometriában az XSight szcintillátor alapú kamerát (Rigaku, Tokió, Japán) vezették be a beállításba. Ez egy vékony egykristályos szcintillátorból, egy tízszeres nagyítási objektívből és egy 2504 × 3326 pixeles CCD-chipből áll, amelynek képpontmérete 0,54 µm. A kúpnyaláb-geometriai kísérletekhez egy lapos panelű CMOS detektort telepítettek GdOS: Tb ​​szcintillációs képernyővel (PerkinElmer, Waltham, USA). 1536 × 1944 pixelből áll, 74,8 μm pixelmérettel. A mérések geometriai és kísérleti paramétereit a kiegészítő fül tartalmazza. S2

Adatfeldolgozás (labor beállítás)

A fázis-helyreállítást a BAC algoritmussal hajtottuk végre az összes rögzített vetületre az S2 kiegészítő táblázatban felsorolt ​​paraméterek felhasználásával. A 3D térfogatrekonstrukció előtt egy wavelet alapú gyűrűkivonási algoritmust alkalmaztunk a szinogramokon 29. A 3D térfogatrekonstrukciót az UltraFast ConeBeam Reconstruction Software (Bronnikov algoritmusok, Arnhem, Hollandia) segítségével szereztük be. Az adatok vizualizálását az Avizo-val (FEI Visualization Sciences Group, Burlington, USA) végeztük. A rózsaszín színkódot úgy választottuk meg, hogy a virtuális metszetek hasonlítsanak a hematoxilinnal és eozinnal festett szövettani metszetekre (H&E festés). Az egyes purkinje sejtek szegmentálását manuálisan végeztük az adatkészlet egy kis részén, míg egy félautomata megközelítést alkalmaztunk a molekulák és a szemcsék rétegében lévő sejtek jelölésére. Itt a cellákat egy küszöbalapú ecset eszközzel jelöltük meg, amely a felhasználó által kézzel kiválasztott régión belül csak szürke értékű pixeleket jelöl meg egy bizonyos tartományon belül.

ID19 konfiguráció (ESRF)

A kísérleteket ID19 sugárvonalon (ESRF, Grenoble, Franciaország) végeztük, párhuzamos sugárgeometriával. A mintát a hullámzó mögött kb. 145 m-rel helyezzük el egy három torony és egy forgástengelyű mintatoronyban, míg a forgástengely helyzete két további fordítással állítható be. A beállítás energiája változó, és ehhez a kísérlethez 18,685 keV-t választunk, fluxusával

Adatfeldolgozás (ID19)