korlátozása

  • Tárgyak
  • Összegzés
  • HÁTTÉR:
  • CÉL:
  • MÓD
  • EREDMÉNYEK
  • KÖVETKEZTETÉSEK
  • Bevezetés
  • Anyagok és metódusok
  • Állatok
  • Napidíj
  • kísérleti protokoll
  • Szövetfehérje-tartalom és biokémiai mérések
  • Izotópos mérések
  • Gén expresszió
  • Statisztika
  • Eredmények
  • Élelmiszerbevitel, állatok növekedése és testösszetétele.
  • Plazma-karbamid, hormonok és aminosavak.
  • A szövetek összetétele, a fehérjeszintézis sebessége és a proteolízis útjának génexpressziója.
  • Vita
  • Kiegészítő információk
  • Word dokumentumok
  • Kiegészítő információk

Tárgyak

  • Anyagcsere
  • Elhízottság
  • Proteolízis

Összegzés

HÁTTÉR:

A magas fehérjetartalmú (HP) étrendeket az energiakorlátozás során alaposan tanulmányozták a testzsír csökkentésére és a sovány testtömeg megőrzésére való képességükről, de a sovány szövetek fehérje-anyagcseréjére gyakorolt ​​hatásukról keveset tudni.

CÉL:

Az energiakorlátozás és a fehérjebevitel hatásának meghatározása patkányok anabolizmusára és fehérje katabolizmusára.

MÓD

5 héten keresztül 56 hím Wistar patkányt tápláltak elhízásindukáló (OI) étrenddel. Ezután az OI-diéta vagy a kiegyensúlyozott HP-étrend alkalmazásával 3 hétig 40% -os energiakorlátozásnak vetették alá őket, míg egy kontrollcsoport ad libitum módon kapta az OI-diétát (n = 8 csoportonként). A HP-korlátozott patkányokat öt csoportba osztották, amelyek csak fehérjeforrásukban különböztek meg: az összes tejfehérje, a kazein (C), a tejsavó (W), az 50% C és W keveréke és a szója (n = 8). Az állatokat étkezés utáni állapotban feláldoztuk, és meghatároztuk testösszetételüket. A fehérjeszintézis sebességét a májban, a gastrocnemiusban és a vesében határoztuk meg szubkután 13 C-valin elárasztó dózisával. Az MRNA-szinteket a proteolízis mindhárom útjában részt vevő kulcsfontosságú enzimekre mértük.

EREDMÉNYEK

Az energia korlátozása, de az étrend összetétele nem, befolyásolta a fogyást és az adipozitást, míg a sovány szövet tömegét (a vese kivételével) az étrend összetétele nem befolyásolta. A neoglikogén aminosavszintek általában az energiakorlátozás alá esnek (P 1, 2 az energia korlátozásának változó szintjét és az étrend energiatápanyag-tartalmának módosítását jelenti, például a zsír- vagy szénhidrát (CHO) fogyasztás korlátozását és a fehérjetartalom növelését. 3, 4 A fehérjékre egy adott tanulmány fókuszál, mivel ezek kielégítő hatásuk miatt csökkenthető az energiafogyasztás 5 és növelhető az alanyok betartása a diétával. 6, 7 Ezenkívül a fehérjében gazdag étrend minimalizálhatja a sovány testtömeg csökkenését alacsony kalóriatartalmú étrend. 8, 9 A fehérjeforrás típusa szintén befolyásolhatja a rágcsálók modelljeiben leírtakat.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy jobban megértse az étrendi makrotápanyagok összetételét, beleértve a fehérjeforrást is, a testösszetételre és a szöveti fehérje anyagcserére a patkányok energiakorlátozása során.

Anyagok és metódusok

Állatok

Valamennyi kísérletet a Francia Állattenyésztési Bizottság iránymutatásainak és a kísérleti célokra használt gerinces állatokról szóló európai egyezménynek megfelelően hajtották végre. Hím Wistar patkányokat (n = 56, 300-320 g) Harlan-tól (Horst, Hollandia) vásároltunk, és azokat ellenőrzött környezeti körülmények között (hőmérséklet, 12 óra sötét periódus 08: 30-tól kezdődően) tartottuk. A patkányok 5 napig szabadon hozzáférhettek a vízhez és a kereskedelmi laboratóriumhoz, mielőtt megkezdődtek a kísérleti étrendhez való étrendi alkalmazkodásuk.

Napidíj

Teljes méretű asztal

A diétákat félfolyékony formában szállították a kiömlés elkerülése és a bevitt mennyiségek nyilvántartásának javítása érdekében. A restrikciós periódus utolsó hetében a patkányok hozzászoktak ahhoz, hogy táplálékukat egy olyan minta alapján kapják meg, amely egy 8:30 és 09:30 közötti első periódusból állt, amely a napi adag 1/3-át adta, és egy második időszak 12: 00 és 18:00 az adag maradékának ellátásával. Az OI patkányokat ugyanazon ütemezésnek vetették alá, de 12:00 és 18:00 között szabad hozzáférést kaptak az élelemhez. Ezt a mintát alkalmazták, hogy az állatokat megszokják, hogy a szokásos étkezést teljes egészében elfogyasszák a kísérleti napon 1 órán belül.

kísérleti protokoll

Szövetfehérje-tartalom és biokémiai mérések

A szöveteket liofilizáltuk és lemértük. Teljes N-tartalmát Dumas módszerrel értékeltük elemi elemzővel (Euro Elemental Analyzer 3000, EuroVector, Milánó, Olaszország), standard alapon atropinnal.

A szövetek teljes fehérjetartalmát (g) P = TM ×% DM ×% N × 6,25/10 000 formában határoztuk meg, ahol TM a nedves szövet tömege (g) és a DM a szárazanyag.

A plazma aminosavkoncentrációkat deproteinizált plazmamintákban oszlop utáni ioncserélő kromatográfiával határoztuk meg ninhidrin származékkal (Biotech Instrument, St Quentin-en-Yvelines, Franciaország). Az inzulin és a leptin koncentrációit egy patkány endokrin panel segítségével (RENDO, Linco Research, Saint Charles, MI, USA) elemeztük Bioplex 200 rendszerben (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA. USA). A karbamid koncentrációkat kereskedelmi készlet segítségével határoztuk meg (Bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Franciaország).

Izotópos mérések

A szöveti fehérjék FSR-jét (%/nap) az alábbiak szerint számítottuk: FSR = Ebound val/(Efree val × t) × 100, ahol az Ebound val és az Efree val a fehérjék nélküli 13C-valin dúsítás a szövetekben. Az abszolút szintézis sebességet (ASR, g/nap) az ASR = FSR × P értékeként számítottuk, ahol P a szövet teljes fehérjetartalma. A teljes izomtömeg a testtömeg 45% -ára becsülték. húsz

Gén expresszió

A teljes RNS-t fagyasztott szövetből extraháltuk TRIzol-reagensekkel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A teljes RNS-koncentrációt 260 nm-en számszerűsítettük, és etídium-bromid festést alkalmaztunk az RNS integritásának megerősítésére. Az első szál (cDNS) komplementer DNS-jének szintézisét 400 ng RNS-ben hajtottuk végre, fordított transzkripciós készlet (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Les Ulis, Franciaország) és PTC-200 termociklizátor (MJ, Waltham, MA) felhasználásával. (USA). A valós idejű PCR-t a „syber green potency PCR master mix” (Applied Biosystems) alkalmazásával, 7300 valós idejű PCR rendszeren (Applied Biosystems) végeztük. Az alapozókat az Oligo Explorer 1.1.0 szoftver (GeneLink, Hawthorne, NY, USA) felhasználásával terveztük. Az alkalmazott PCR-primerek szekvenciája a következő volt: 5'-ACACTGGCTCCTCAACCTG-3 '(előre) és 5'-TCCACCTTGATACCTCCTAAG-3' (visszafelé) katepszin D-re (NM_134334), 5'-CGCACCCTCTCTGACTACA-3 '(hátra). '-GCCCTCTTTATCCTGGATCT-3' (hátul) ubiquitin (Ubb, NM_138895), 5′-GGAAAACAAACGGGAGTATG-3 ′ (elülső) és 5′-ACACAACGACGATGGAAAG-3 ′ (hátul) enzim 14 kDa EAG2 esetében és 5'-GAAGTAGAAGAAGGAGGTCG-3 '(fordított) m-kalpainra (NM_017116), 5'-GGGAGCCTGAGAAACGGC-3' és 5'-GGGTCGGGAGTGGGTAATTT-3 '18S esetén.

Az összes PCR-reakciót az alábbiak szerint hajtottuk végre: denaturálás 95 ° C-on 10 percig, 40 amplifikációs ciklus minden ciklusban 15 másodpercből állt 95 ° C-on, majd 1 percig 60 ° C-on. Az egyes minták ciklusküszöbét (CT) állandó fluoreszcencia küszöbvonalon határozzuk meg. 18S riboszomális RNS amplifikációkat alkalmaztunk a cDNS kezdeti mennyiségének változékonyságának figyelembevételéhez, és a plakkok közötti variációkat korrigáltuk RT kalibrátorral.

A génexpressziót a 2 -ΔCt képlettel határoztuk meg, ahol 2 a PCR optimális hatékonyságát és a célgént ΔCt = Ct - Ct 18S jelenti. A PCR hatékonyságát minden lemezen meghatároztuk a reverz átírású RNS soros hígításával.

Statisztika

Az adatokat átlag ± sd-ben fejezzük ki. A csoportos hatást egyirányú ANOVA-val (9.1 verzió; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) elemeztük, és post-hoc Tukey teszteket végeztünk több összehasonlítás céljából. Az energia-korlátozás és a fehérjeszint hatásait a modellen belüli kontraszt-állításokkal elemeztük OI csoportokban, illetve korlátozott csoportokban. A fehérjeforrás hatását a HP-R csoportokban elemeztük. A növekedési görbék esetében az adatokat kevert modell alkalmazásával elemeztük, ismételt tényezőként az időt. P

Patkánynövekedés az 5 hetes OI periódus alatt és a 3 hetes energiakorlátozás alatt. Átlag ± sd (n = 8). Az egyértelműség kedvéért csak egy HP-R csoportot mutatunk be, a korlátozott csoportok közötti különbség hiánya miatt. * jelentősen eltér a kontrollaktól (vegyes modell ismételt mérésekkel, post hoc Tukey-teszt). OI, kontroll patkányok táplálták az OI ad libitum étrendjét; OI-R, korlátozott energiájú patkányok OI étrenden; HP-MP-R, energiatartalmú patkányok az összes MP-t tartalmazó HP diéta alatt.

Teljes méretű kép

A testösszetételt energiakorlátozás befolyásolta, míg a diéták makrotápanyag-összetételének (azaz fehérjeszintnek vagy fehérjeforrásnak) nem volt hatása (2. táblázat). A vese volt az egyetlen szerv, amelyben a fehérje szint jelentősen megnövelte a súlyt. Az energiakorlátozás csökkentette a zsírpárnákat, míg a sovány szöveteket csak kis mértékben érintette az energiakorlátozás. Nem voltak különbségek a testösszetételben a különböző korlátozott csoportok között, függetlenül az étrendjük fehérjetartalmának szintjétől és jellegétől.

Teljes méretű asztal

Plazma-karbamid, hormonok és aminosavak.

A metabolitokat és a plazma hormonokat 2 órával étkezés után mértük (3. táblázat). Az uremia 64% -kal volt magasabb HP patkányokban, mint OI patkányokban (P

A plazma aminosavkoncentrációk, amelyeket az energia korlátozása, a fehérjeszint és/vagy a fehérjeforrás befolyásolt. Átlag ± sd (n = 8). OI, kontroll patkányok táplálták az OI ad libitum étrendjét (fekete sáv); OI-R, korlátozott energiájú patkányok OI diétán (nyitott sáv); HP-R, korlátozott energiájú patkányok a HP diéta alatt (szürke sávok) különböző forrásokból származó fehérjékkel (MP; W; CW; C; S). A fő statisztikai hatásokat minden grafikon feltünteti: energia korlátozás (ER), fehérjeszint (PL), fehérjeforrás (PS).

Teljes méretű kép

A szövetek összetétele, a fehérjeszintézis sebessége és a proteolízis útjának génexpressziója.

A máj, a gastrocnemius izom és a vese fehérjetartalmát, FSR-jét és ASR-jét a 4. táblázat tartalmazza. Az összes HP-R csoport eredményeit összesítettük, mivel a fehérjeforrás semmilyen hatást nem okozott. Az energia korlátozása és a fehérje szintje nem befolyásolta a fehérjetartalmat és a fehérjeszintézis fluxusát ezekben a szövetekben, FSR vagy ASR alkalmazásával értékelve.

Teljes méretű asztal

A májban az étrend nem befolyásolta a katepszin D, az ubiquitin, az E2 enzim és az m-Calpain expresszióját (3. ábra). Ezzel szemben a proteolízis útvonalakban részt vevő gének RNS-szintje jelentősen megnőtt a vese energia-korlátozásával, és csökkent a fehérjeszint korlátozott energiájú étrendben, mind a négy enzim esetében. Megfigyelték az ubiquitin, az E2 enzim és az M-kalpain fehérjeforrásának hatását is, az MP-csoportban a Cas és S-hez képest magasabb expressziós szint felé fordultak. A gastrocnemius izomban a proteolízis enzimek génjeinek expressziója ( kivéve a katepszin D-t) az energia korlátozásával általában növekszik, míg a HP szint drasztikusan csökkenti mind a négy enzim expresszióját.

Patkányok proteolízis útjának génjeinek (katepszin D, ubiquitin, E2 enzim, m-kalpain) relatív expressziója a májban, a gastrocnemius izomban és a vesében 3 hét energia-korlátozás után. Átlag ± sd (n = 8). OI, kontroll patkányok táplálták az OI ad libitum étrendjét (fekete sáv); OI-R, energiatartalmú patkányok OI diétán (nyitott sáv); HP-R, korlátozott energiájú patkányok a HP diéta alatt (szürke sávok) különböző forrásokból származó fehérjékkel (MP; W; CW, C és W keverék; C; S). A fő statisztikai hatásokat az egyes grafikonok mutatják: csoport, energiakorlátozás (ER), fehérjeszint (PL), fehérjeforrás (PS).

Teljes méretű kép

Vita

Ez a tanulmány kimutatta, hogy 40-45% -os energiakorlátozásnak kitett patkányokban a fogyást és a testösszetételt elsősorban az energiakorlátozás befolyásolta, míg az étrend összetételének és a fehérjeforrásnak nincs szignifikáns hatása. A HP szint javította a keringő glükóz és a vér lipidjeit, míg az energia korlátozása csak a szabad zsírsavakat csökkentette. A HP szint ellensúlyozta a keringő neoglikogén aminosavak növekedésének tendenciáját az energia korlátozása következtében. A fehérjeszintézis sebességét nem befolyásolta sem az energia korlátozása, sem az étrendi fehérjeszint, míg a vese és az izomban a kulcsfontosságú proteolízis enzimek túltermeltek voltak energia korlátozás alatt, és rosszul expresszálódtak, amikor a fehérje szint emelkedett. Ezek a proteolízis útvonalak modulációi azonban nem befolyásolták a sovány tömeg csökkenését, függetlenül az étrend fehérjetartalmától.

Következtetésként elmondható, hogy azoknál a felnőtt elhízott patkányoknál, akiket 3 hétig 40% -os energiakorlátozásnak vetettek alá, súlyukat és zsírvesztésüket csak a kalóriabevitel vezérelte, függetlenül a makrotápanyagok összetételétől. A sovány tömeg megmaradt a fehérje szintjétől függetlenül, és a fehérje anyagcseréjét csak kis mértékben befolyásolták, kivéve az izom és a vese proteolízis útjait, ahol az étkezés utáni aktiválást energia korlátozással egy HP szint ellensúlyozta. Végül, amikor a fehérjeszint magas volt, az összes fehérjeforrás hatásukat tekintve egyenértékű volt.