Összegzés
A krioelektromos mikroszkópokat, akár pásztázó (SEM), akár transzmissziós (TEM), széles körben alkalmazzák biológiai minták vagy más, nagy víztartalmú anyagok jellemzésére 1. SEM/fókuszált ionnyalábot (FIB) használnak az érdekes tulajdonságok azonosítására mintákban, és vékony, átlátszó elektronfóliát extrahálunk a krio-TEM-be való átvitelhez.
Absztrakt
Bevezetés
Az FIB-t széles körben használják a TEM-minták előállítására számos előnye érdekében. 7. Hogy csak néhányat említsek: a nagy energiájú ionok használata közel normál előfordulással minimalizálja az anyaggal kapcsolatos differenciál őrlési sebesség hatását; az ömlesztett mintából vett terület mikronnál kisebb pontossággal választható; nagyon kis mennyiségű anyag kerül eltávolításra. Néhány legújabb technikai fejlődés lehetővé tette a FIB alkalmazását a TEM minták előállításához is 2,8-10 kriogén hőmérsékleten. Számos előnye van a hagyományos, főként lágyanyag-mintáknál alkalmazott 11, 12 kriomikrotómia-előkészítési módszerrel szemben, mint például a szeletelt lap mechanikai deformációjának hiánya, a késnyomok hiánya és az összetett minták elkészítésének lehetősége. kemény/puha interfészek vagy alkatrészek.
Jegyzőkönyv
Megjegyzés: A protokollban feltüntetett összes paraméter érvényes az itt feltüntetett műszerekre és modellekre. Ezen paraméterek egy része (a szövegben * -gal jelölve) eltérő lehet, ha másik gyártót vagy modellt használ.
1. A FIB/SEM megvalósítása
2. A minta lefagyasztása
3. Maróion
4. Cryo transzfer a TEM-be
Reprezentatív eredmények
Ebben a munkában a következőket alkalmazták: kettős gerenda FIB/SEM, nanomanipulátorral és kriogén kamrapreparátummal felszerelve; egy TEM krio-transzfer támogatással; krioprototípus-átadó állomás. A krio-előkészítő kamra anticontaminator (AC) pengéit és a nanomanipulátor (NM) hegyét Gatan módosította. A szokásos kriokamrához képest az AC csapok nagyobbak, hogy nagyobb hőelnyelőt biztosítsanak az NM csúcs számára. Ezenkívül a légkondicionáló fel van szerelve bilincsekkel a Cu fonatok összekapcsolására a hőcseréhez az NM csúccsal. A FIB/SEM gumiabroncsait úgy módosították, hogy lehetővé tegyék az NM-t abban, hogy bent legyen, még akkor is, ha a mintakamrát szellőztették. Meg kell jegyezni, hogy az ebben a munkában használt paraméterek a legmegfelelőbbek a fent említett berendezésekhez; Ezeknek a paramétereknek a beállításához szükség lehet más típusú berendezésekkel való munkavégzéshez. A protokoll használatához be kell tartani a kriogén anyagok, a nitrogén és a folyadék vákuumrendszerek kezelésének szokásos óvintézkedéseit.
1.ábra. Cryo-SEM kép az A. niger spóráiról, Pt lerakódás előtt.
2. ábra. Ugyanaz a terület az 1. ábrán Pt lerakódás után, de megkötés előtt.
3. ábra. Cryo-SEM kép a 2. ábrán ugyanarról a területről, 52 ° -kal lejtve, Pt lerakódás és kikeményedés után, árokmarással folyamatban (lásd 3.7. Lépés).
4. ábra. Penge, készen áll a kiemelésre.
5. ábra. A hideg nanomanipulátor hegy érintkezik a fóliával.
6. ábra. Egy második Pt krio-lerakódást használnak a nanomanipulátor és a fólia összehegesztésére.
7. ábra. A hideg nanomanipulátorral a fóliát a TEM rács rögzítési területére viszik át.
8. ábra. A krio-lerakódást még egyszer alkalmazzák a fólia TEM rácsra történő rögzítésére.
9. ábra. A fólia levágásra kerül a nanomanipulátortól, és készen áll az elektronok tárolására vagy az elvékonyodó átlátszóságra.
10. ábra. A hígítás egy közbenső lépése, keresztmetszetében néhány spóra látható.
11. ábra A minta Cryo-SEM képe a végső elvékonyodás után; a többi spóra nagy része hajlamos volt eldarálódni, mert a fólia hullámosodni kezdett.
12. ábra. A lap összetett Cryo-TEM képe. A sarok egy részét a lamella tartalmazza (fekete nyíl).
Vita
A krio-lerakódás jellege miatt (3.5., 3.10. És 3.13. Lépés) a minta nagy része le lesz fedve, így akadályozva az eredeti felület kilátását. Ez megnehezítheti a megtérülés nyomon követését, hacsak nem használnak több márkát a 3.3 lépésben javasoltak szerint.
A 4.5. És 4.7. Lépés során fennáll annak a veszélye, hogy a vékony filmek levegővel érintkeznek. Ezt el kell kerülni, mivel a levegő nedvessége jégkristályokat képezhet a minta felületén, esetleg a fontos jellemzők elfedéséig. Ezeket a lépéseket a lehető leghamarabb el kell végezni, ugyanakkor valószínűleg a minta elvesztését eredményezi a seyo transzfer során történő helytelen kezelés miatt. Javasoljuk, hogy a felhasználó gyakorolja ezeket a lépéseket üres TEM rácsok használatával, mielőtt megkísérelné a tényleges mintát.
Az anyagtudományban a FIB műszer a forgalmazásától számított egy évtized alatt a vezető TEM minta-előkészítési módszerré vált. Mivel gyakorlatilag bármilyen mintán használható, így nincs szükség az előkészítési technika testreszabására a minta típusához. Meggyőződésünk, hogy kriogén hőmérsékleten ugyanez történhet az itt részletezett eljárásnak köszönhetően. Nagyobb mintákra való alkalmazása még mindig függ a krioprezerválás képességétől üveges állapotban, de az olyan technikák, mint a fagyasztásmerítés vagy a 3,5-es nagynyomású fagyasztás, optimális megoldásnak bizonyulhatnak erre a problémára.
Közzétételek
A szerzőknek nincs mit közölniük.
Köszönetnyilvánítás
Ez a kutatás a QNano projektből kapott támogatást: http://www.qnano-ri.eu, amelyet az Európai Közösség kutatási infrastruktúrái finanszíroznak a FP7 Kapacitások Programja keretében (INFRA-2010 támogatás: 262 163).
Köszönetet mondunk a kutatási tanácsnak A pénzügyi támogatás formái.